论文部分内容阅读
植物为了生存和适应环境进化出形态多样化的器官与细胞。例如,被子植物为了繁衍后代,其花瓣进化出多种形态与颜色,花瓣表皮进化出独特的锥形细胞,是为了吸引传粉昆虫。植物器官和细胞是如何发育为特定的形态是植物学研究领域的一个重要的科学问题。植物的器官例如花瓣和叶片适应生态环境进化出各种形态,受到精密的遗传调控。器官的形态建成主要取决于各向异性生长,即在空间上的不均一生长。有许多基因被鉴定出调控器官的大小、形态;但是器官生长与形态建成的分子遗传调控机制还有待于进一步研究。在细胞水平上的改变与器官生长的关联也需要更多的研究。因此,通过经典的遗传学突变体筛选,鉴定新的功能基因对加深理解器官生长与形态建成具有重要意义。拟南芥ANGUSTIFOLIA（AN）是动物CtBP/BARs（C端结合蛋白/BFA诱导的腺苷二磷酸核糖基化底物）的同源蛋白。CtBP/BARs的功能在动物中已经被广泛研究,然而在植物中AN的功能研究还不太清楚。AN参与拟南芥叶片器官形态建成、微管骨架排列以及抗胁迫防御。AN功能缺失突变体的器官（叶片、花瓣等）与野生型比较,具有宽度变窄、各向异性增强的表型。但是,AN如何协同其他基因调节器官生长与形态建成的分子遗传机制还不清楚。本研究通过EMS化学诱变筛选AN功能缺失突变体an-2的增强子,获得能够增强an-2花瓣各向异性生长（increased petal growthanisotropy）表型的一个突变体ipga1-1。与野生型相比,ipga1-1的花呈现为更长更窄的各向异性增强的表型。利用基因图位克隆技术以及基因组高通量测序发现ipga1-1突变体中At4g18570基因编码序列的第1401个碱基发生突变,密码子从TGG（色氨酸）突变成TGA（终止密码子）。本研究命名该基因为IPGA1。通过分析IPGA1的2个T-DNA插入突变体ipga1-2（SALK137332C）、ipga1-3（SAIL523C10）的表型发现,它们与ipga1-1具有一样的花瓣表型。此外,等位实验分析ipga1-1分别和ipga1-2、ipga1-3杂交的F1代花瓣表型,进一步证明IPGA1突变就是引起ipga1-1突变体表型的原因。此外,构建了IPGA1启动子驱动的IPGA1基因表达载体,对ipga1-1突变体进行互补验证,突变体表型获得恢复。由此,确定At4g18570突变就是ipga1-1突变体获得表型的原因。获得IPGA1基因At4g18570信息后,发现它是一个功能未知的基因。亚细胞定位分析表明,IPGA1定位在周质微管上。经过氨基酸序列比对,发现IPGA1蛋白N端具有coiled-coil的结构域。拟南芥中没有与IPGA1全长高度同源的蛋白,但是有3个基因与IPGA1的羧基端具有同源性。通过原核表达获得纯化的His-IPGA1蛋白,用微管共沉淀实验证明了它与微管直接结合。用FRAP（荧光漂白恢复）技术分析IPGA1荧光漂白恢复时间,与已知微管结合蛋白恢复时间相近。分析了IPGA1蛋白截断在拟南芥子叶中瞬时表达的定位情况,发现IPGA1 1-200个氨基酸截断蛋白具有微管共定位现象。因此,推测IPGA1是一个新发现的微管结合蛋白。为了研究IPGA1的基因表达模式,构建了IPGA1启动子融合GUS报告基因载体,并转化野生型拟南芥植株。GUS活性检测显示:GUS在拟南芥的子叶、根、花瓣、萼片等器官和组织中表达。同时,qRT-PCR结果显示,IPGA1在花瓣中表达量高于其他器官,特别在花瓣发育晚期表达量最高。此外,利用稳定表达pACT2-GFP-IPGA1/ipga1-2的转基因株系,观察到GFP-IPGA1蛋白在拟南芥细胞中有表达,并且与微管共定位。为了研究IPGA1的生理功能,本研究详细统计分析了ipga1突变体与IPGA1过表达株系器官与细胞的表型。结果显示在ipga1突变体中,器官和细胞均发生各向异性生长增强的表型（更长更窄）:突变体子叶、真叶、花瓣、萼片等器官与野生型相比,均有显著的各向异性增强。同时花瓣近轴面（靠近花柱一面）细胞的底座呈现拉长状态。远轴面细胞也有伸长的表型,且成熟期的细胞边缘凸起个数显著减少,细胞边缘平滑。而IPGA1过表达株系中,器官各向异性减少:子叶变圆,真叶变短,花瓣变短而宽。IPGA1突变对细胞分裂过程没有影响,但是对细胞膨大与各向异性生长有影响,导致了器官水平的形态异常。总之,IPGA1是器官各向异性生长的一个负调控因子。IPGA1是一个新的微管结合蛋白,为了进一步研究IPGA1对细胞微管骨架组织与排列的调控作用,通过ipga1-1与微管的marker株系GFP-Tubulin6（GFP-TUA6）杂交。发现突变体花瓣成熟的远轴面表皮细胞的微管排列与对照GFP-TUA6细胞的微管相比,表现为更加平行有序化。并且在花瓣发育过程stage8到stage14中,突变体细胞中的微管排列逐渐变为有序化。IPGA1过表达株系中细胞的微管排列呈现出无序化。这表明了IPGA1在细胞生长过程中是一个微管有序化排列的负向调控因子。为了探讨IPGA1与AN的遗传关系,我们详细分析了ipga1与an-2单突变体以及ipga1 an-2双突变体的器官的表型。结果显示:ipga1增强an-2的器官各向异性,而且ipga1 an-2双突变体表型不仅仅是单突变表型简单叠加效应,而是在遗传关系上存在协同作用。这表明了IPGA1与AN在调控花瓣器官生长的遗传途径上存在相互作用。综上分析,本研究通过遗传突变体筛选,发现了IPGA1是AN的调控器官生长与形态的增强子。并发现IPGA1是一个新的微管结合蛋白。进一步对IPGA1的生理功能进行分析,证明IPGA1对细胞的微管骨架阵列和稳定性方面有作用,从而在拟南芥细胞生长与器官形态建成方面有重要的功能。遗传分析表明IPGA1与AN存在遗传协同作用。这对理解器官与细胞形态建成的分子遗传调控网络具有重要的科学意义。