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经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是临床上治疗肝癌的主要方法之一，但术后缺血、缺氧导致的肿瘤新生血管形成已成为影响其远期疗效的主要因素之一。抗肿瘤新生血管生成的基因治疗是目前肿瘤治疗学领域中的研究热点，反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)技术作为肿瘤基因治疗的主要手段之一，技术开展成功的关键是选择安全有效的基因导入载体，而纳米粒是近年来发展起来的一种新型基因载体，能保护寡核苷酸，提高基因的转染效率。1992年缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)的发现使得调控缺氧诱导基因成为一种新的治疗热点。研究表明HIF-1α是缺氧适应和病理反应中的一个重要中介因子，可以调节多种缺氧应激蛋白的基因表达，上调多种促血管生成因子的表达，增强细胞的无氧酵解能力，在肿瘤的生长、浸润和转移中起重要作用。但目前探讨TACE治疗对肝癌HIF-1α表达的影响及其与肿瘤新生血管生成相关性的研究尚未见报道。TACE术后残瘤组织是否通过上调HIF-1α的表达而促进了肿瘤新生血管的形成和术后残瘤组织的血构重建，进而能否借助以HIF-1α为靶点的抗肿瘤新生血管生成治疗来抑制TACE术后的肿瘤新生血管形成，从而进一步提高TACE的远期疗效，这是本课题的设计思路和出发点。本实验共分三部分，第一部分通过动物实验和分子生物学方法探讨TACE对兔VX2肝移植瘤HIF-1α表达的影响及其与TACE术后肿瘤新生血管生成的相关性，旨在进一步揭示TACE术后肿瘤新生血管生成的机理；第二部分选择PLGA作为纳米载体材料，应用复乳化-溶剂挥发法制备包载HIF-1α反义寡核苷酸PLGA纳米粒子，并对其一般性质、载药量、包封率及体外释药特性等进行测定，以评价PLGA作为纳米载体材料制备包载HIF-1α反义寡核苷酸纳米粒子作为纳米载药控释系统的可行性；第三部分旨在通过动物实验和分子生物学方法进一步评价携带HIF-1α反义寡核苷酸纳米粒子对兔VX2肝移植瘤TACE术后肿瘤新生血管生成的抑制作用，进而为临床上肿瘤的治疗提供新的思路。实验材料和方法1．构建兔VX2肝移植瘤模型将冷冻的VX2肿瘤细胞株组织块复苏、剪碎，制成悬液，接种于兔大腿部皮下制备荷瘤兔；切取荷瘤兔后腿肿瘤边缘的灰白色鱼肉样组织，剪成约1mm~3大小瘤块备用；实验兔采用剑突偏左肋缘下纵行切开，直视下瘤块直接种植法将瘤组织块植入肝左叶内，建立兔VX2肝移植瘤模型；2周后行肝脏螺旋CT双期动态扫描，观察肝内肿瘤生长情况。2．制备载HIF-1α反义寡核苷酸PLGA纳米粒应用复乳化-溶剂挥发法制备包载HIF-1α反义寡核苷酸PLGA纳米粒子，并固定其他因素，选择不同的PVA浓度和乳化速度，观察其对制备的纳米粒粒度和载药量的影响；应用电镜和粒度测定仪对制得的纳米粒进行形态观察和粒径测定；应用高效液相色谱法测定纳米粒的载药量和包封率并进行体外释药试验；应用光学显微镜及肉眼观察载药纳米粒与碘油混悬液的物理稳定性。3．实验动物分组及处理方案(1)实验一：24只实验兔随机分为3组，每组8只。对照组经肝动脉注入生理盐水2ml／只；TAE组行单纯碘油(UFLP)栓塞，UFLP 0.5～0.8ml／只；TACE组行碘油、吡柔比星(UFLP+THP)混悬液栓塞，UFLP 0.5～0.8ml／只，THP 2mg／只。(2)实验三：32只实验兔随机分为4组，每组8只。TACE组行常规TACE治疗，栓塞剂为碘油、吡柔比星(UFLP+THP)混悬液；PLGA组行碘油、吡柔比星与空白PLGA(UFLP+THP+PLGA)混悬液栓塞；ASODN组行碘油、吡柔比星与单纯HIF-1α-ASODN(UFLP+THP+HIF-1α-ASODN)混悬液栓塞；NP组行碘油、吡柔比星与载HIF-1α-ASODN PLGA纳米粒(UFLP+THP-HIF-1α-ASODN PLGA NP)混悬液栓塞。各组UFLP用量为0.5～0.8ml／只；THP用量为2mg／只；B组空白PLGA用量为2mg／只；C、D两组按含HIF-1α-ASODN 5 OD／只量给药。4．TACE操作方法实验兔常规右侧腹股沟区脱毛、消毒、铺巾，轴向切开皮肤，暴露并游离股动脉，用18G穿刺套管针穿刺股动脉，置入4F血管鞘，4F Cobra导管与3F SP导管配合行超选择插管、血管造影和栓塞治疗。5．结果观察及标本制备手术后2周分别对实验兔行肝脏螺旋CT扫描，观测肝脏肿瘤生长和碘油沉积情况，然后处死动物，剖腹切取肝脏标本，大体观察后取与躯干纵轴垂直的最大平面切开瘤体，观察肿瘤大小、坏死情况和残瘤组织生长情况，最后取肿瘤及瘤周肝组织标本置于10％福尔马林液内固定。6．免疫组织化学染色检测采用通用型二步法。分别检测肿瘤组织中HIF-1α、VEGF的表达，用CD34单克隆抗体标记肿瘤血管内皮细胞，计数肿瘤组织中的微血管密度。HIF-1α表达判定标准参照Birner等的方法；VEGF表达判定标准参照Park等的方法；MVD计数判断标准参照Weidner等的方法。结果实验1：肿瘤呈圆形或椭圆形，浸润或膨胀性生长，治疗前各实验组肿瘤体积无明显差别(P＞0.05)，治疗后肿瘤体积均增大，但TAE和TACE两组肿瘤体积与增长率较对照组有显著差异(P＜0.01)，TAE和TACE两组间差异无统计学意义(P＞0.05)；TAE组和TACE组HIF-1α的阳性表达均高于对照组，三组HIF-1α表达的强阳性率分别为12.5％，62.5％，50％，组间比较TAE组较对照组有显著差异(P＜0.05)，但TACE组较对照组无显著差异(P＞0.05)；三组中TAE和TACE组VEGF阳性表达均高于对照组，VEGF表达的强阳性率分别为25％，50％，50％，组间比较差异无显著性(P＞0.05)；三组MVD值分别为51.63±4.90、67.08±4.57、63.50±4.93，TAE组和TACE组MVD值较对照组高，组间比较有显著性差异(P＜0.05)，TAE组较TACE组高，但组间比较无显著性差异(P＞0.05)；三组HIF-1α的表达与VEGF表达及MVD的变化呈正相关(r_s=0.537，P＜0.01；r_s=0.486，P＜0.05；r_s=0.423，P＜0.05)。实验2：制得的载HIF-1α-ASODN PLGA纳米粒外观呈圆形或界于圆形与椭圆形之间，表面光滑圆整，粒径分布范围较窄，平均粒度为(320±50)nm，纳米粒载药量为(0.93±0.015)％，包封率为(79.14±1.78)％；纳米粒中HIF-1α-ASODN在24小时突释期内累积释放率为31.2％，10天内呈缓慢线性稳定性释放，释放量达81.5％：经观测，载HIF-1α-ASODN PLGA纳米粒与碘油混悬液具有较好的物理稳定性。实验3：治疗后肿瘤体积以NP组增长最小，组间比较，TACE和PLGA两组差异无统计学意义(P＞0.05)，ASODN和NP两组与TACE组比较差异有统计学意义(P＜0.05；P＜0.01)，ASODN与NP两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；治疗前后兔血清AST、ALT的变化各组间比较无显著性差异(P＞0.05)；各组HIF-1α表达的强阳性率分别为50％，62.5％，25％，0，NP组与TACE组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；VEGF表达的强阳性率分别为50％，50％，25％，0，其中NP组与TACE组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；MVD值组间比较，ASODN和NP两组与TACE和PLGA两组间差异明显，ASODN和NP组与TACE组比较差异有统计学意义(P＜0.05；P＜0.01)，NP组与ASODN组比较差异有统计学意义(P＜0.05)：四组HIF-1α的表达与VEGF表达及MVD值的变化呈正相关(r_s=0.470，P＜0.01；r_s=0.406，P＜0.05；r_s=0.374，P＜0.05)。结论1．采用兔腹股沟区皮肤轴向切开，游离并暴露股动脉，18G穿刺套管针穿刺股动脉，置入4F血管鞘，能成功地进行兔VX2肝移植瘤的超选择插管血管造影和栓塞治疗。2．HIF-1α在TACE术后残瘤组织的血供重建过程中发挥核心调控作用，TACE能明显上调HIF-1α的表达，HIF-1α通过密切调控其下级基因VEGF的表达而促进肿瘤新生血管生成。3，应用高速搅拌-溶剂挥发技术制备包载HIF-1α-ASODN PLGA纳米粒子，方法实用有效，工艺稳定，重复性好。4．制得的载药PLGA纳米粒子球体大小均匀，粒径分布范围较窄，平均粒度为320nm左右，具有明显的缓释效应。5．HIF-1α-ASODN能抑制TACE术后肿瘤新生血管生成，而载HIF-1α-ASODNPLGA纳米粒子能明显提高基因转染的效率，抑制TACE术后肿瘤血管生成的作用更加明确。6．TACE与抗肿瘤血管生成治疗联合应用，相互补充，可以达到更好的临床治疗效果，将成为肝癌治疗学新的发展方向。