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香蕉(Musa spp.)是热带性常绿草本果树,是世界第四大水果,也是继水稻、小麦和玉米之后的第4大粮食作物。建立高效的‘粤优抗1号’香蕉品种胚性细胞悬浮的再生体系,将为缩短‘粤优抗1号’香蕉品种的生长周期和提高其耐寒性等基因工程育种奠定基础。通过将CaMV35S组成型启动子驱动霍乱毒素B亚基与人胰岛素融合基因(CTB-INS)导入到香蕉基因组中,生产可接直食用的香蕉CTB-INS疫苗,将为Ⅰ型糖尿病的治疗提供更经济有效的途径。进行防御素alfAFP与几丁质酶Bbchitl对香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝生长的抑制作用研究和南瓜韧皮部特异基因PP2启动子转化香蕉的研究,将为利用强韧皮部特异启动子驱动广谱活性的抗真菌蛋白基因转化香蕉,提高香蕉对香蕉枯萎病抗性的研究提供依据。
本研究在优化‘粤优抗1号’香蕉ECS的再生体系的基础上,以‘粤优抗1号’ECS为受体,利用农杆菌介导法分别将CaMV35S驱动CTB-INS目的基因的植物表达载体pBI121-CTB-INS、南瓜韧皮部特异启动子NPP2和CaMV35S组成型启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体pBdENP和pB1121进行遗传转化研究;通过毕赤酵母表达系统表达了苜蓿防御素alfAFP和球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1这两种蛋白,进行体外抑菌实验,比较这两种蛋白对香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝生长的抑制作用。主要研究结果如下:
(1)探讨了不同浓度的TDZ对‘粤优抗1号’香蕉ECS再生的影响,建立了高效的‘粤优抗1号’ECS的再生体系,以1mg/L的TDZ浓度效果最好,再生率达50%。
(2)经过筛选培养,共获得转CTB-INS基因的抗性植株135株,经过nptⅡ、chvA、35S和CTB-1NS引物的PCR检测,有2株检测出nptⅡ、CTB-INS和35S阳性带,没有检测出chvA条带,说明DNA样品没有受到根癌农杆菌的污染。将这2株阳性植株进行Southern杂交检测,这2株阳性植株杂交出了CTB-INS阳性带。PCR检测和Southern杂交结果表明,已成功将目的基因CTB-INS转进香蕉的基因组。
(3)经过筛选培养获得了转pBI121的抗性植株36棵,转pBdENP的抗性植株48棵。经nptⅡ、35S和chvA引物的PCR检测,共检测出5株转pBI121和4株转 pBdENP的阳性植株,都没有检测出chvA条带,说明DNA样品没有受到根癌农杆菌的污染。经Southern杂交验证,获得了转pBI121和转pBdENP的转基因植株各1株。
(4)成功将空载体pPIC9K载体转化进GS115酵母菌的基因组中,获得了高拷贝的GS115-pPIC9K酵母菌株,并利用毕赤酵母表达系统表达了防御素alfAFP和几丁质酶Bbchit1这两种蛋白以及空载体pPIC9K蛋白。体外抑菌实验表明,防御素alfAFP的抑制效果要比几丁质酶Bbchit1的好,达到了显著与极显著差异。