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脑卒中(stroke)具有高发病率、高死亡率、高致残率以及高复发率的特点。脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中,其中缺血性脑卒中所占比例高达60%-80%。溶栓治疗是目前最有效的治疗缺血性脑卒中的方式之一。溶栓治疗使血管再通,然而再灌注会进一步加重神经元的凋亡,造成缺血再灌注损伤(I/RI)。造成脑缺血再灌注损伤的机制十分复杂,可能与细胞内钙离子超载、自由基过度形成、炎症的发生发展、神经元凋亡以及兴奋性氨基酸毒性等机制相关。到目前为止,脑缺血再灌注损伤的分子机制尚未阐明,因此,深入研究脑缺血再灌注损伤可能的分子机制,为有效治疗脑卒中提供实验依据,具有重要的理论意义和临床应用价值。食欲素A(Orexin-A)是一种兴奋性神经肽,通过与其受体(OX1R-orexin 1receptor和OX2R-orexin 2 receptor)结合发挥生物学作用,Orexin-A主要与OX1R结合并激活下游信号通路,进而影响机体的病理生理学过程。Orexin-A不仅在食欲、睡眠与觉醒、奖赏与寻求等方面发挥着重要作用,在心血管疾病等方面也发挥着重要作用。研究证实大鼠大脑中动脉阻塞后OX1R在缺血侧皮层的表达逐渐增加,且Orexin-A可能通过抑制神经元的凋亡,从而发挥神经保护作用。但是对于Orexin-A在缺血再灌注损伤中的神经保护作用和可能的机制尚不清楚,基于以往研究我们提出假设:Orexin-A/OX1R可能是通过激活或者抑制下游信号通路来抑制神经元的凋亡,从而发挥保护作用。本实验采用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型及体外建立原代海马神经元氧-糖剥夺(OGD)模型,旨在研究Orexin-A在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其分子机制,从而为缺血性脑卒中发病机理提供新的实验依据。实验步骤如下:大鼠随机分为以下几组:假手术组(Sham组)、缺血2 h组、模型组(I/R)、生理盐水(NS)干预组、Orexin-A干预组、LY294002抑制剂干预组、LY294002+Orexin-A干预组。首先利用免疫荧光技术定位OX1R在海马区域的表达。然后采用线栓法制作MCAO模型,缺血(I)2 h及再灌注(R)不同时间(R6、12、24 h)后提取海马组织,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术及蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测OX1R在mRNA及蛋白水平的表达变化。缺血2 h拔出线栓后侧脑室注射0.9%生理盐水及Orexin-A,利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色技术检测大鼠脑梗死体积,从而验证Orexin-A是否具有神经保护作用。Western blotting技术检测不同处理组ERK磷酸化的表达变化,验证Orexin-A是否改变ERK磷酸化的表达水平;并且进一步利用PI3K抑制剂LY294002干预实验,检测Orexin-A是否通过激活PI3K-ERK信号通路发挥作用。此外,在离体细胞水平培养新生wistar大鼠海马原代神经元,制作氧-糖剥夺(OGD)模型后复氧培养24 h(R24 h)。实验设置三组:Control组、OGD/R24 h组、OGD/R24 h+Orexin-A干预组,利用CCK-8试剂盒以及荧光染色技术观察Orexin-A是否能够降低因氧-糖剥夺引起的神经元的凋亡及神经元形态的变化。实验结果显示:动物实验结果中,免疫荧光染色显示OX1R在海马内表达。与缺血2h相比,OX1R在mRNA水平I/R12 h后较高表达(p<0.05),在蛋白水平I/R12 h时表达量最高(p<0.001),因此我们选用大鼠再灌注时间为12 h(R12h),且上述实验表明,OX1R在海马内表达并且参与脑缺血再灌注损伤过程。TTC结果显示,I/R组大鼠出现明显的脑梗死体积,经Orexin-A干预后脑梗死体积明显下降(p<0.001),提示Orexin-A干预能显著降低因缺血再灌注导致的脑梗死体积。Western blotting结果表明,与Sham组相比,I/R组大鼠p-ERK蛋白的表达明显升高(p<0.05),而Orexin-A干预组与I/R组相比,Orexin-A能够显著降低因缺血再灌注引起的p-ERK蛋白的高表达(p<0.05),结果提示Orexin-A通过改变ERK蛋白的磷酸化水平参与脑缺血再灌注损伤过程。经PI3K抑制剂LY294002干预后,与I/R组相比,p-ERK蛋白的表达明显降低(p<0.001),经Orexin-A与抑制剂LY294002共刺激后,与LY294002干预组相比,p-ERK蛋白的表达明显升高(p<0.001),表明Orexin-A激活了PI3K-ERK信号通路发挥作用。细胞实验中,CCK-8实验结果表明,与Control组相比,氧-糖剥夺培养8 h显著降低细胞的OD值(p<0.01)。Orexin-A刺激后,与OGD/R24 h组相比,OD值明显升高(p<0.05),表明Orexin-A处理可以明显抑制因氧-糖剥夺引起的神经元凋亡。激光共聚焦结果显示OGD/R24 h组神经元突起数量显著减少,而Orexin-A处理显著改善由氧-糖剥夺诱导的神经元形态及突起数量的改变。上述结果表明,Orexin-A通过激活PI3K-ERK信号通路显著降低大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗死体积,并抑制神经元凋亡,进而发挥神经保护作用。通过本实验得出以下结论:Orexin-A可以降低脑梗死体积,抑制神经元的凋亡,并且Orexin-A通过作用于OX1R,激活PI3K-ERK信号通路调节ERK磷酸化的表达,参与大鼠脑缺血再灌注损伤过程中发挥神经保护作用。本研究为脑缺血再灌注损伤过程中,Orexin-A的神经保护作用的信号转导途径和作用机制提供详实资料,对于脑卒中的药物研发和临床救治具有重要的理论意义和应用价值。