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通过筛选EMS诱变的水稻(shishoubaimao,SSBM)突变体库,获得一个短根突变体(ssbm short root,Osssr-1),其伸长区缩小,成熟区细胞长度是野生型的1/3。
图位克隆结果表明:该突变基因位于第四号染色体短臂上,在基因(LOC_04941970)基因组的第2947个碱基处发生了T到A的点突变,导致蛋白序列上第451个脂肪族类亮氨酸(Leu)突变为碱性氨基酸类组氨酸(His)。该基因在网站CAZY上(http://www.cazy.org/GH9_eukaryota.html)被命名为OsGLU3,是一个假定的β-1,4-葡聚糖内切酶,该类酶水解纤维素内的β-1,4-糖苷键。转基因回复实验及该基因的T-DNA插入突变体Osglu3-2进一步证明Osssr-1突变表型是由于OsGLU3突变造成的。
观察可以回复突变体表型的proOsGLU3::OsGLU3::GUS转基因植株,发现该基因在根、侧根、叶、不定根原基及颖壳的颖毛上表达,特别是在根的伸长区和成熟区、侧根根尖,不定根原基的根冠表达强烈。
利用可以回复突变体表型proOsGLU3::OsGLU3::sGFP转基因植株,观察蛋白OsGLU3的亚细胞定位,发现该基因在亚细胞中的定位是发育依赖的,在分生区及伸长区分布于细胞质内小体及质膜上分布,在成熟区定位于质膜上。当FM4-64(细胞内吞途径指示剂)处理该转基因植株后,OsGLU3-GFP与FM4-64部分共定位,说明OsGLU3参与了细胞内吞途径。BFA(囊泡运输抑制剂)处理后,OsGLU3-GFP与FM4-64完全共定位,说明OsGLU3也在高尔基体上定位,很可能是通过囊泡运输运输的质膜行使功能。
突变体Osglu3也是一个温度敏感的突变体,在26℃根长接近野生型,340℃恒温下突变表型加剧。而T-DNA插入突变体Osglu3-2没有表现出对温度的敏感性,说明OsGLU3在Leu451上的点突变导致蛋白对温度敏感。
CYCB1,1:GUS(分生区报告基因)在突变体中的表达区域缩小,说明OsGLU3参与了根分生区的调控。
施加3%外源的葡萄糖、纤维二糖完全回复突变体表型,施加外源3%的蔗糖、果糖显著回复突变体Osglu3表型,3%外源葡萄糖也可以部分回复T-DNA插入突变体Osglu3-2的根系长度,说明外源糖回复突变体表型是有其他基因的参与。
突变体Osglu3根内的葡萄糖含量与野生型没有明显差异,根细胞壁中纤维素含量明显低于野生型,而地上部中没有降低,说明OsGLU3在水稻根系纤维素合成有着重要作用。
缺磷条件可以部分回复突变体表型,根伸长区缩短表型消失,CYCYB1,1:GUS标记的分生区扩大,成熟区细胞长度部分回复;缺氮却加剧突变体根伸长区缩小表型;定量PCR结果发现野生型中磷饥饿下表达没有被诱导,复饥饿条件下被诱导表达,在突变体中则恰好相反。氮磷饥饿不能回复T-DNA插入突变体的表型,说明OsGLU3在氮磷饥饿诱导根系伸长途径中有重要的作用,可能是通过促进细胞的分裂与伸长来实现根系伸长。
所以我们得出结论:OsGLU3调控根细胞壁纤维素合成,影响根细胞的分裂及细胞的伸长,从而调控根系的发育,是氮磷饥饿诱导根系伸长途径中的关键基因。