论文部分内容阅读
溞属种类是常见的淡水枝角类,在水生食物链中起着十分重要的作用。枝角类的生活史具有孤雌生殖和两性生殖两种生殖方式。通常,孤雌生殖雌体在环境恶化时所产出的卵,可以孵化出雄体,再行两性生殖。因此,枝角类是研究生殖转化和性别决定的重要类群。目前,有关溞属种类生殖转化和雄性性别决定的分子机制研究较少。本研究对中华拟同形溞的不同发育阶段进行转录组测序,从中筛选出了与生殖转化和雄性性别决定相关的候选基因,为后续开展溞属种类功能基因的鉴定和分子调控机制研究提供参考。对中华拟同形溞雌性幼体（JF）、孤雌生殖雌体（PF）、两性生殖雌体（SF）、雄性成体（M）等4个发育阶段进行转录组测序,共获得110437条transcripts,22996条unigenes。将获得的unigenes与Nr数据库进行相似序列匹配,与其同源性序列比例最高的近缘物种是大型溞（70.5%）。在JF、PF、SF和M的4个发育阶段中,特有的unigenes数量分别为2863、445、437和586,共同的unigenes数量为9708。将4个发育阶段的基因进行两两比较（PF vs JF、SF vs JF、PF vs SF、M vs JF、M vs PF、M vs SF）,分别得到了两个发育阶段间的差异表达基因（DEGs）。GO注释分析发现,SF和M中的上调基因均富集到水解酶活性、肽酶活性等功能上。选取SF与其他3个阶段比较（SF vs JF、SF vs PF、SF vs M）的前30个上调DEGs进行RT-q PCR实验。从中筛选出25个在SF中的表达量极显著高于其他3个阶段的基因（P<0.01）,推测它们可能是与中华拟同形溞生殖转化相关的候选基因。其中,包括可能与中华拟同形溞SF卵鞍形成有关的角质层蛋白基因（Cluster-5789.221:cuticular protein,Cluster-5789.225:cuticular protein）、弹性蛋白基因（Cluster-5789.207:pro-resilin）和羧肽酶基因（Cluster-5789.11727:zinc carboxypeptidase A1）;可能与SF中休眠卵的发生和发育有关的丝氨酸蛋白酶相关基因（Cluster-5789.7107:putative serine protease nudel,Cluster-5789.8755:serine protease inhibitor dipetalogastin-like protein）和卵细胞发育相关基因（Cluster-5789.1075:prostaglandin D2 synthase-like protein,Cluster-5789.6612:putative cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 1,Cluster-5789.13610:peroxinectin-like protein）。选取M与其他3个阶段比较（M vs JF、M vs PF、M vs SF）的前30个上调DEGs进行RT-q PCR实验。从中筛选出38个在M中的表达量显著高于其他3个阶段的基因（P<0.05）,推测它们可能是与中华拟同形溞雄性性别决定相关的候选基因。其中,包括在其他溞属种类中被证明可能参与性别分化的双性基因（Cluster-5789.12340:doublesex2）;与中华拟同形溞雄性性腺发育有关的层粘连蛋白基因（Cluster-5789.8159:laminin subunit gamma-3）;与精子激活有关的胰蛋白酶基因（Cluster-5789.9553:trypsin-7-like protein,Cluster-5789.3677:putative trypsin-7,Cluster-5789.9554:putative trypsin-7,Cluster-5789.11655:trypsin alpha-like,Cluster-5789.7668:trypsin-like isoform X1）和丝氨酸蛋白酶基因（Cluster-5789.2039:serine protease ami-like）;以及在中华拟同形溞两性间表现出性别二态性表达的几丁质合成酶基因（Cluster-5789.11830:chitin synthase 2）和几丁质酶基因（Cluster-5789.6658:chitinase 3,Cluster-5789.5191:chitinase 5,Cluster-5789.7417:chitinase 8）。此外,在中华拟同形溞的转录组中,发现了一些在其他溞属种类中已确认的与生殖转化（CSP2,CSP3,dsx1,dsx2,Tra）和雄性性别决定（dsx1,Tra,DMRT93B,antp）相关的基因。本研究中,中华拟同形溞雄体中dsx1和dsx2的表达量显著高于3个雌体发育阶段,雄体中的antp表达量显著高于雌性成体（PF,SF）中的表达量,暗示它们同样参与了中华拟同形溞中的雄性性别决定过程。