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心钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)主要由心脏分泌的一种小肽类激素,参与了血压调节和机体内环境的动态平衡。近年来研究发现ANP及其受体在哺乳动物卵巢和输卵管中广泛存在。一般认为促性腺激素通过cAMP信使促进卵母细胞的成熟。现在研究表明cGMP也参与卵母细胞的成熟和精子顶体反应。ANP可与受体结合,激活粒性鸟苷酸环化酶,使cGMP水平上升,从而可能在生殖系统中具有重要的生理作用。本文以猪和大熊猫为对象,研究了ANP在卵母细胞成熟和精子功能中的作用及机理。 实验一研究了ANP对猪卵丘细胞包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes,CEOs)体外成熟和卵丘扩散的影响。当猪CEOs在添加有卵泡液的培养液中培养时,ANP剂量依赖性负调节FSH诱导的生发泡破裂(在FSH,FSH+10 nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的GVBD分别为:90.1:81.2和68.2%),第一极体排出(在FSH,FSH+1nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的PB1分别为86.1;75.3和53.3%)和卵丘扩散(在FSH,FSH+1nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的卵丘扩散指数分别为3.47;3.16和2.43)。该影响也表现出时间依赖性。当猪CEOs培养在无卵泡液的培养液中时,ANP显著抑制FSH诱导的GVBD(47.6%vs.83.8%)和IPB1的排出(22.4%vs.45.2%).cGMP类似物8-Br-cGMP(10μM-1 mM)可模拟ANP对GVBD、PB1和卵丘扩散的影响。ANP的作用可完全被cGMP依赖性的蛋白激酶(PKG)抑制剂KT5823所抑制,而与ANP受体C特异结合的C-ANP-(4-23)对卵母细胞体外成熟没有影响。ANP和C-ANP-(4-23)对猪卵母细胞自发成熟没有影响。这些结果表明,ANP负调节FSH诱导的猪卵母细胞减数分裂恢复、减数分裂成熟和卵丘扩散。ANP对卵母细胞成熟的影响是通过cGMP依赖性的蛋白激酶(PKG)实现的。 实验二重点研究了ANP在猪卵母细胞成熟过程中的作用机制。结果表明ANP能抑制FSH诱导的猪卵母细胞成熟和卵丘扩散,并阻止卵母细胞和卵丘细胞中有丝分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的完全磷酸化。ANP的抑制作用可被8-Br-cGMP模拟,而蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)抑制剂KT5823却能完全逆转。扎普司特(zaprinast)(cGMP特异的磷酸二酯酶抑制剂)能增强ANP在卵母细胞成熟中的作用。C-ANP-(4-23)(特异地与钠肽受体C(NPRC)结合的类似物)对FSH诱导的和自发的猪卵母细胞成熟没有影响。用毛喉素(forskolin,一种腺苷酸环化酶激动剂)培养猪卵母细胞得到两种不同的结果:培养44h可诱导卵丘扩散但抑制卵丘包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes,CEOs)成熟,而培养2h可诱导卵母细胞成熟。ANP和C-ANP-(4-23)都能抑制forskolin对CEOs的成熟影响,而其抑制作用百日咳毒素(pertussis toxin,PT)阻止,表明ANP和C-ANP-(4-23)对forskolin的抑制作用是通过调节卵丘细胞上的Gi蛋白实现的。所有这些结果表明ANP通过两种不同的信号机制调节FSH和forskolin在猪卵母细胞成熟中的作用:一是通过cGMP/PKG通路,另外一种是通过卵丘细胞上的NPRC受体,并激活PT敏感的Gi蛋白通路。 实验三研究了ANP及其受体在猪精子和输卵管中的表达以及其ANP对猪精子功能的影响。RT-PCR分析表明,精子中仅存在钠肽受体A(natriuretic peptide receptors-A,NPRA)基因的表达。ANP mRNA水平在输卵管1期(OT1)、3期(OT3)和5期(OT5)中较高,在2期(OT2)中较低。NPRA mRNA水平在OT1和OT2期较低,OT3期开始上升,到OT4、OT5期达到最高。ANP能诱导猪精子发生顶体反应。当用1nM ANP处理时,其诱导顶体反应的百分率最高(34.1±2.3%)。C-ANP-(4-23)和咖啡因都对猪精子的顶体反应没有影响。ANP对精子顶体反应的影响