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程序性细胞死亡配体-1(PD-L1/B7-H1)是存在于多种肿瘤细胞细胞膜上高表达的一种跨膜蛋白。它可以与效应T细胞上的PD-1(程序性细胞死亡因子1)蛋白结合,传导免疫抑制信号,抑制免疫效应T细胞的活性,有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。已有的研究表明PD-L1免疫检查点抑制剂能特异性地与PD-L1结合,阻断PD-1/PD-L1通路,解除对T细胞活性的抑制,从而增强机体的抗肿瘤免疫力(提高T细胞杀伤肿瘤的能力),进而达到抗肿瘤的效果。然而临床研究发现免疫检查点抑制剂也存在一些临床局限性。PD-L1在细胞中的表达受一些内在机制的调控,如:FOXO、NF-κB、HIF-1、STAT3、SRF以及STAT1等信号通路的调控。肿瘤细胞内组成型致癌因素会通过这些信号通路促进PD-L1的过度表达。实验目的:鉴于免疫检查点抑制剂在临床应用过程中存在一些局限性,本研究拟从调控PD-L1表达的信号通路着手,尝试降低肿瘤细胞细胞膜表面PD-L1的表达水平。整个课题分为以下六个部分:1)利用各信号通路抑制剂检测各信号通路对PD-L1表达的调节作用;2)信号通路报告基因筛选体系的构建;3)利用构建的报告基因体系对中药单体药物进行筛选;4)利用流式细胞术验证筛选的中药单体对肿瘤细胞PD-L1的下调作用;5)对验证后的中药单体化合物开展细胞杀伤实验;6)对检测后确定的中药单体化合物开展体内实验。研究方法与结果:1)利用流式细胞术检测6种信号通路抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞表面PD-L1表达的调节作用。结果表明信号通路STAT3、STAT1的抑制剂对MDA-MB-231细胞表面PD-L1的表达具有下调的作用。2)稳定表达STAT3、STAT1及ISRE(STAT1/2)转录因子荧光素酶报告基因系统的构建及验证:利用分子克隆的酶切、连接等基本操作,构建相应的重组基因表达载体;通过质粒转染构建稳定表达的单克隆细胞株Raw264.7-STAT3、A549-STAT1及A549-ISRE。结果发现Raw264.7-STAT3细胞株对IL-6的刺激呈浓度梯度依赖性,表明受STAT3转录因子调控的稳定表达STAT3荧光素酶的细胞系构建成功,可用于筛选与STAT3活化调控相关的药物;而A549-STAT1、A549-ISRE细胞株对IFNγ的刺激无变化,故没有获得稳定表达STAT1、ISRE荧光素酶的细胞系。3)利用构建好的Raw264.7-STAT3细胞株筛选中药单体化合物,以Nluc/OD值为依据,筛选可抑制STAT3活化的中药单体化合物。结果共筛选获得十二种可下调STAT3信号通路的中药单体化合物。4)将筛选获得的单体化合物作用于MDA-MB-231细胞及人肺癌细胞A549,以肿瘤细胞PD-L1及HLA的表达量为指标,以二甲双胍(Metformin)为阳性对照,利用流式细胞术筛选能够下调肿瘤细胞PD-L1的同时对HLA无下调或下调作用不明显的中药单体化合物。结果共筛选获得Y028、Y162、Q002、L011、X045、E011、B7、A9八种单体化合物及药物Metformin。5)通过细胞杀伤实验对筛选获得的九种化合物进行效果验证。将人外周血淋巴细胞(PBMC)用刺激因子CD3、CD28激活后,加入IL-2进行刺激为细胞毒性T淋巴细胞,并利用流式验证T细胞活性后;将MDA-MB-231-Fluc细胞与CTL细胞共培养,并加入中药单体,过夜培养后,计算实验组与相应空白组内MDA-MB-231细胞的活率;结果表明单体化合物Y028、E011、A9、B7及药物Metformin能增强T细胞的杀瘤效果。6)NU/NU裸鼠体内检测中药单体的促进T细胞杀瘤效果:在小鼠左第四乳垫部位皮内接种MDA-MB-231-Fluc细胞,后将刺激后的T细胞经尾静脉回输至NU/NU小鼠,三天回输一次T细胞,同时每天腹腔注射筛选出的单体化合物,用小动物活体成像系统检测所筛选中药单体是否能增强T细胞的杀瘤效果。结论:1)本实验证明STAT1、STAT3和FOXO信号通路与PD-L1的表达相关。2)成功构建了稳定表达的STAT3转录因子报告基因系统,并通过该系统筛选出十二种可调控该转录因子表达的中药单体化合物。3)中药单体化合物 X045、E011、B7、A9、L011、Y162、Y028、Q002 等都可下调MDA-MB-23 1细胞PD-L1的表达。4)中药单体化合物Y028、E011、A9、B7,药物Metformin等可促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。5)中药单体化合物B7及药物Metformin可在CTL回输裸鼠尾静脉抑瘤作用中起促进作用。