牦牛肉营养丰富,但保水性较低,影响了食用加工品质。因此,控制宰后汁液损失,减少经济损失是牦牛肉加工产业中亟待解决的重要问题。目前研究认为,蛋白质的变化影响宰后肌肉保水性,但是由于蛋白质组成的复杂性,其机理尚不完全明晰。因此,结合多种分析测试手段,探索宰后牦牛肉保水性变化机理具有重要意义。本文以牦牛背最长肌为主要研究对象,以黄牛作为对照,利用蛋白质组学技术手段探究了宰后成熟过程中滴水损失、蒸煮损失的变化规律,明确了代谢酶、结构蛋白和应激蛋白与肌肉保水性的关系。并以此为理论依据,利用生物信息学分析揭示了牦牛肉中蛋白质影响保水性的代谢通路,以期阐明牦牛肉中保水性形成的途径及原因。主要研究结果如下:1.确定了牦牛肉不同保水性组的品质指标,并进行了相关性分析。以滴水损失、蒸煮损失为变量对32头牦牛进行了聚类分析。根据欧式距离5,32个样品被分为高保水性组(n=12,1.91%≤滴水损失≤2.59%,29.91%≤蒸煮损失≤32.80%)和低保水性组(n=12,3.73%≤滴水损失≤4.01%,34.55%≤蒸煮损失≤39.72%)。高保水性组样品与低保水组样品相比,其pH、a*值、弹性、咀嚼性、总蛋白溶解性、肌浆蛋白溶解性、肌浆蛋白溶解性高,肌节长度长。相关性分析结果显示,保水性相关品质指标具有很强的相关性,pH的降低造成蛋白质的变性,包括结构蛋白和呈色蛋白,呈色蛋白中最重要的肌红蛋白氧化成高铁肌红蛋白,造成a*的下降,b*的升高。因此,造成牦牛肉保水性降低的原因可能归结于pH值的下降、蛋白质变性和肌纤维结构的变化。2.确定了牦牛背最长肌双向电泳的最优条件。通过多重条件的对比,适合牦牛肉背最长肌的双向电泳条件是:裂解液II法进行牦牛肌肉全蛋白提取、渐进式快速升压程序和改良的考染法染色。在该最优条件下获得的蛋白点匹配率高,得到分辨率高,背景清晰的图像。3.明确了牦牛肉中影响滴水损失的差异蛋白质,并进行了生物信息学分析。利用质谱分析技术对高滴水损失(HDrip)组和低滴水损失(LDrip)组中的差异蛋白质进行鉴定,筛选出55种差异表达蛋白。所得到的蛋白分为五类,分别是代谢酶、结构蛋白、应激蛋白、转运蛋白及其他类蛋白质。对差异表达蛋白质进行层次聚类分析,结果显示,在宰后第0、1、7d,分别有24、30、20个蛋白的丰度上调(LDrip组高于HDrip组);7、11、11个蛋白点丰度下调(LDrip组低于HDrip组)。进而对发生显著性变化的差异表达蛋白质磷酸丙糖异构酶(TIM)、肌球蛋白轻链(MLC)、热休克蛋白27(HSP27)进行了免疫印迹验证,结果显示,三种蛋白质在LDrip组中灰度值均高于HDrip组,且宰后成熟过程中,免疫印迹灰度值均呈现下降趋势,与双向电泳结果呈现相同的趋势。GO分析结果显示,55种蛋白质主要富集在细胞(cell)、细胞器(organelle)和胞外组分(extracellular region)中;差异蛋白质主要起连接(binding)、催化活性(catalytic activity)和结构分子(structural molecule activity)作用;差异蛋白参与的生物过程主要在组织过程(single-organism process)、细胞转化过程(cellular process)和代谢过程(metabolic process)中。通过蛋白质相互作用网络分析,得到影响牦牛肉滴水损失的核心蛋白,基因名称分别是TPI1(TIM),PKM(丙酮酸激酶),LDHA(L-乳酸脱氢酶A链),ENO3(β-烯醇化酶),NDUFB1(NADH脱氢酶),ATP5A1(ATP合酶),HSPB27(热休克蛋白27),MYL(肌球蛋白轻链),TNNI1(肌钙蛋白I)和DES(Desmin)。差异表达蛋白质可以归纳为两类,一类是与糖酵解途径和能量代谢相关的酶,另一类是与细胞结构相关的蛋白质。4.明确了牦牛肉中影响蒸煮损失的差异蛋白质,并进行了生物信息学分析。利用质谱分析技术对高蒸煮损失(HCL)组和低蒸煮损失(LCL)组中的差异蛋白质进行鉴定,筛选出26种差异表达蛋白。所得到的蛋白分为四类,分别是代谢酶、结构蛋白、应激蛋白及转运蛋白。对差异表达蛋白质进行层次聚类分析,结果显示,有14种蛋白质的丰度在HCL组中高于LCL组,有12种蛋白质的丰度在HCL组中低于LCL组。进而对发生显著性变化的差异表达蛋白质肌间线蛋白(Desmin)、肌钙蛋白T(TnT)、乳酸脱氢酶(LDH)进行了免疫印迹验证,结果显示,Desmin和TnT在高、低蒸煮损失组中趋势与双向电泳结果相同,LDH在两组间变化趋势与双向电泳结果相似。GO分析结果显示,26种蛋白质主要富集在细胞(cell)、细胞器(organelle)和细胞膜(membrane)中;差异蛋白质主要起连接(binding)、催化活性(catalytic activity)和结构分子(structural molecule activity)作用;差异蛋白参与的生物过程主要在组织过程(single-organism process)、细胞转化过程(cellular process)和代谢过程(metabolic process)中。通过蛋白质相互作用网络分析,差异表达蛋白质可以归纳为两类,一类是与糖酵解途径和能量代谢相关的酶,另一类是与细胞结构相关的蛋白质。与蛋白质组分析一致,LDH、TnT和Desmin是蛋白质相互作用网络中的关键蛋白。5.明确了牦牛与黄牛肌肉的差异蛋白质组,并进行了生物信息学分析。利用质谱分析技术对检测到的差异蛋白质进行鉴定,筛选出19种不同的差异表达蛋白。结果表明,造成牦牛、黄牛不同物种间肌肉生物学特性差异的主要蛋白质包括代谢酶、结构蛋白和应激蛋白,这些蛋白质主要涉及到的代谢通路包括细胞能量代谢、碳水化合物代谢、遗传物质信号通路、蛋白质合成与分解过程,涉及这些代谢通路的生理生化反应最终造成了牦牛、黄牛保水性的差异。其中,细胞代谢(38%)、碳水化合物代谢(31%)和能量代谢(8%)相关的蛋白质在代谢通路分类中约占77%,确定了蛋白质代谢过程在牦牛、黄牛肉质形成过程中的重要性。6.通过维恩图法对不同滴水损失牦牛肉、不同蒸煮损失牦牛肉、黄牛对照组进行分析,得出影响牦牛保水性的12种蛋白质,分别是LDH、CKM、β-烯醇化酶、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、二氢硫辛酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Desmin、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、MLC和HSP27。在Ex PASy服务器中使用Protparam工具对经过免疫印迹验证分析的LDH、TIM、MLC、TnT、Desmin和HSP27 6个蛋白质进行了蛋白质疏水性分析,结果显示LDH、TIM、TnT和HSP27蛋白中的疏水性区域较广,疏水性得分较高。即表明,氨基酸的高疏水性可以增强蛋白质和水之间的排斥,这可能是导致牦牛肉中保水性较弱的原因之一。使用Wolf PSORT软件进行亚细胞定位预测。差异表达的蛋白质在细胞中分为8个位置,差异蛋白质大多位于细胞质、细胞核和线粒体中。7.阐明了宰后牦牛肉中影响保水性的三种不同途径。第一种途径为:牦牛为适应高原环境而产生高原习服现象,通过增加糖酵解来支持和维持ATP的产生。牦牛肉中糖酵解酶强度增加,引起宰后牦牛肉中pH下降,肌肉内静电荷减少,引起牦牛肉中保水性降低。第二种途径为:蛋白质的降解和变性作用使肌原纤维紧缩,能潴留不易流动水的空间变小,同时,结构蛋白形成疏水键,使牦牛肌肉内保水性降低。第三种途径为:应激蛋白通过维持肌原纤维蛋白的稳定、防止微丝等细胞骨架蛋白降解,调节维持宰后肌肉中保水性平衡,HSP27蛋白变化较为明显。综上可知,本研究采用蛋白质组学方法,研究牦牛肉宰后成熟过程中蛋白质变化规律,并以黄牛作为对照,找到了影响牦牛保水性的12种关键蛋白质,阐明了宰后牦牛肉中影响保水性的三种不同途径。从蛋白质分子、肌肉细胞、肌肉保水性不同层面,深入阐明宰后成熟过程中牦牛肉的保水性机制,为解释牦牛肌肉生物学特性和肉品质差异提供有意义的理论依据。