神经干细胞(Neural Stem Cell,NSC)是指具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能生成大量脑组织细胞的细胞群。在胚胎期,神经干细胞主要分布在大脑的皮层、海马、纹状体和中脑等区域;在成年期,神经干细胞主要局限在海马齿状回SGZ、环绕侧脑室的室脑膜下层SVZ和纹状体。神经干细胞因其具有自我更新能力和分化能力,通过移植神经干细胞给治疗神经退行性疾病带来了新的希望,因而对神经干细胞的增殖和分化的研究是最近几年的热点。神经干细胞的增殖受到多方面因素的影响和调节,其中内因主要有基因、神经干细胞内蛋白、转录因子等,外因则包括神经干细胞的营养因素、细胞间相互作用、各种理化因素如低氧等。在哺乳动物中由于脑部区域的特殊构造,通常情况下在胚胎发育阶段和成年脑组织中氧含量只有3%-5%,称之为“生理性低氧”。因此,研究生理性低氧情况下神经干细胞的增殖情况具有重要的生理意义。本实验即在生理性低氧条件下开展对神经干细胞增殖特性的研究,从细胞代谢的角度阐释低氧对神经干细胞增殖的调控作用。自噬(autophagy)是溶酶体介导细胞内蛋白质和细胞器降解的正常新陈代谢过程,在维持细胞自身内环境稳定,保护细胞免受应激损伤等方面发挥着重要作用。在各种应激状态下,自噬被激活,可以清除细胞内异常折叠的蛋白质和衰老、受损的细胞器,促进细胞的存活,但如果细胞自噬被过度激活,细胞自噬压力超出细胞自身可调节的程度,也会加速细胞的死亡。在神经干细胞的低氧过程中自噬会起到什么作用还不得而知。Wip1(Wild type p53-induced phosphatase 1)是一种原癌基因,属于丝氨酸/苏氨酸家族成员的磷酸酶,因此关于Wip1的研究主要集中在识别Wipl的靶蛋白与去磷酸化位点上。到目前为止已经发现至少7种Wipl靶蛋白,包括与细胞增殖周期密切相关的p53、p38等,Wip1通过使p53、p38发生去磷酸化解除它们抑制细胞增殖的作用,从而在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用。那么,在神经干细胞低氧过程中Wip1是否参与对细胞增殖的调控?该调控作用是否与自噬调节相关?本文将就这些问题分别进行讨论。在本研究中,我们采用3%O2低氧模型(以20%O2为常氧对照)首先探讨了低氧条件下神经干细胞中自噬的变化,及其对细胞存活的影响;然后检测了Wip1在低氧过程中的表达变化及其对细胞存活和自噬的影响,并进一步分析了Wip1与自噬在低氧条件下调节神经干细胞增殖时的关联。研究结果如下:1.低氧对神经干细胞活性的影响我们采用常氧(20%)和低氧(3%)对神经干细胞进行不同时间的处理,通过比较低氧和常氧对神经干细胞的存活和增殖的影响,以及不同氧浓度条件下神经干细胞中活性氧ROS的变化,探究低氧对神经干细胞活性的影响。1.1神经干细胞分离和培养取SD大鼠14.5天胚胎的中脑,接种于含有EGF,b FGF等因子的无血清培养基中,原代细胞经过一天的培养就可以观察到神经干细胞的增殖现象,神经干细胞悬浮在培养液中,2到3天可以观察到神经干细胞形成神经球,悬浮生长5天左右可以经消化传代。1.2神经干细胞的鉴定为了证明我们所分离培养的细胞是神经干细胞,我们取生长状态良好、大小合适的神经球,进行Nestin染色鉴定。实验结果显示,神经干细胞生长时成球状,神经球中绝大部分细胞显示Nestin染色阳性,结果证实我们培养的细胞确实为神经干细胞,且细胞纯度较高,可以进行后续的实验。1.3低氧对神经干细胞存活的影响我们用CCK-8实验比较不同氧浓度、不同低氧处理时间对神经干细胞存活能力的影响。实验结果显示,神经干细胞经过3%低氧24 h、48 h、72 h处理后存活能力显著提高,表明3%低氧能够显著促进神经干细胞的存活。1.4低氧对神经干细胞增殖的影响为了进一步探究低氧对神经干细胞增殖的影响,我们通过Brd U和HPI(Hypoxyprobe?-1 Kit)低氧探针掺入法观察了不同氧浓度下神经干细胞的增殖状态。结果显示:神经干细胞经过3%低氧处理后Brd U阳性细胞较常氧组明显增加,并且Brd U阳性细胞主要分布在神经球的外围,表明该部位是神经干细胞增殖的主要区域。1.5低氧对神经干细胞中ROS含量的影响低氧与ROS联系密切,正常含量的ROS可作为第二信使影响细胞周期,过量的ROS将会造成细胞损伤。我们进一步应用ROS荧光分子探针孵育神经干细胞,经过染色后用流式细胞仪检测分析。结果显示:与常氧对照组相比,神经干细胞经过3%低氧处理不同时间点后ROS都明显升高,48 h时增加最为显著,其含量增加了约2.5倍,低氧72 h ROS含量降低,但仍明显高于常氧对照组。1.6自噬(线粒体自噬)抑制剂Mdivi-1对神经干细胞中ROS含量的影响ROS主要是在线粒体中产生,线粒体自噬作为自噬的一种类型,我们又进一步检测了线粒体自噬抑制剂Mdivi-1处理神经干细胞24 h后神经干细胞中的ROS含量,结果显示:与常氧对照组相比,低氧组和常氧给药组ROS含量增加明显;与低氧组相比,低氧给药组ROS水平明显升高,以上结果提示3%低氧下ROS含量适度增加,抑制自噬(线粒体自噬)后神经干细胞中的ROS水平明显升高,且低氧下增加更多。2.低氧对神经干细胞自噬的影响自噬是细胞的一种代谢机制,当细胞中ROS水平过高时会激发自噬来保护细胞免受过量ROS带来的伤害。为阐明低氧下神经干细胞的自噬水平及其与ROS和细胞存活的关系,我们分别进行了以下实验:2.1低氧条件下神经干细胞自噬水平的变化将神经干细胞进行3%低氧处理,在不同时间点应用Western Blot、免疫荧光等方法观察其自噬情况。结果显示:和常氧对照组相比,经过3%低氧处理后神经干细胞的自噬水平显著增加。2.2抑制自噬阻碍神经干细胞的增殖为了进一步验证自噬对神经干细胞存活的影响,我们应用自噬抑制剂3-MA处理神经干细胞,不同时间点后对其进行CCK-8检测。结果显示:抑制自噬后无论是低氧还是常氧条件下神经干细胞的存活能力均降低,在低氧下降低尤其显著,这提示自噬对神经干细胞的增殖有显著影响。3.低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达变化及其在细胞增殖中的作用Wip1作为与细胞增殖周期蛋白密切相关的磷酸酶,在细胞增殖过程中发挥着重要作用。为了探究低氧条件下Wip1对神经干细胞增殖的调节作用,我们进行了以下实验:3.1低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达变化我们首先检测了不同氧浓度不同时间点神经干细胞中Wip1的表达情况。结果显示:在常氧条件下,Wip1在神经干细胞中有少量的基础性表达;在3%低氧处理后Wip1的表达量明显升高。我们进一步应用real-time PCR技术检测不同氧浓度不同时间点处理神经干细胞后Wip1的m RNA水平,发现低氧处理24 h和72 h,与常氧对照相比,低氧组的Wip1 m RNA无明显改变,低氧48 h其m RNA水平明显低于常氧组,这些数据提示Wip1的转录活性并没有贡献低氧下Wip1蛋白水平的增加。1.6自噬(线粒体自噬)抑制剂Mdivi-1对神经干细胞中ROS含量的影响3.2敲低Wip1后观察神经干细胞的存活情况为了进一步探究在低氧下Wip1对神经干细胞增殖的作用,我们应用si RNA技术敲低Wip1的表达,在低氧不同时间观察其对神经干细胞存活能力的影响。结果显示:用si RNA敲低Wip1表达,常氧和低氧下神经干细胞的存活能力都有所降低。3.3敲除Wip1后观察神经干细胞的存活情况进一步用Wip-/-小鼠来源的神经干细胞经低氧处理不同时间后同样发现低氧组与常氧组相比神经干细胞的存活率明显下降,且随时间增加更为显著,提示Wip1在低氧促神经干细胞增殖的过程中发挥着重要的调控作用。3.4敲低Wip1后对神经干细胞自噬活性的影响通过上述研究我们发现,自噬和Wip1都参与低氧下对神经干细胞增殖的调控,但是二者在调控神经干细胞增殖中的相互作用尚不清楚。为探明在低氧过程中Wip1与自噬的关系,我们先用Wip1 si RNA转染神经干细胞,然后以Western Blot检测si RNA干预Wip1后对神经干细胞自噬活性的影响。结果显示:应用Wip1 si RNA后低氧对神经干细胞自噬的激活作用受到抑制,常氧组未发现明显变化。综上所述,本研究证实了在低氧(3%)条件下神经干细胞的增殖能力增强,自噬水平随低氧时间增加而升高,同时发现在该低氧条件下神经干细胞中Wip1的表达水平升高,并初步阐明Wip1在调节神经干细胞增殖和促进自噬方面发挥重要作用。总之,本研究首次发现了低氧条件下在神经干细胞增殖过程中自噬和Wip1可能存在关联,这为探索低氧促进神经干细胞增殖的分子机制提供了新的思路。我们将在以后的研究中更深入地探讨自噬和Wip1在介导低氧促进神经干细胞增殖过程中的相互作用。脑卒中是一类严重危害人类健康的疾病,已经逐渐成为威胁人类生命的主要杀手。我国作为世界上人口最多的国家,随着人民生活水平的提高,我国的老年人数量在显著增加,与之而来的一些与年龄有关的疾病发病率也逐年增加,脑卒中作为其中的一种给患者本人及其家庭带来了的严重的负面影响。在脑卒中中其最主要类型是缺血性脑卒,缺血性脑卒中主要是由大脑动脉栓塞造成局部供血不足引起,可对脑组织造成严重损伤。由于缺血性脑卒中发病急促、治疗的时间窗短,危害严重,只有少数患者能够得到及时的治疗,因此进一步探究缺血性脑卒中的病理生理过程,为进一步的防治提供参考就显得尤为重要。自噬(autophagy)是一种细胞自身古老的自我保护机制,线粒体自噬作为其中的特殊类型,近年来成为研究的热点。线粒体自噬(mitophagy)是指在ROS(Reactive Oxygen Species,ROS)、营养缺乏、缺血/缺氧、细胞衰老等外界刺激的作用下,线粒体发生损伤或老化,受损线粒体被特异性识别包裹进自噬体中并进一步与溶酶体融合,从而将受损线粒体降解的过程,其概念由Lemasters等人在2005年首次提出,其最基本内容是:线粒体被自噬体包裹并运送至溶酶体进行分解代谢的过程。线粒体自噬活动受到多种分子蛋白的调节,而BNIP3作为其中的一种,其作用越来越受到关注。BNIP3(Bc1-2/adenovirus E1B 19 k D protein interacting protein 3)隶属于Bcl-2蛋白超家族,可与腺病毒转录基因E1B编码的E1B19k D蛋白或Bcl-2蛋白相互作用,在体内主要定位于线粒体外膜,BNIP3启动子区因含有结合HIF-1(HypoxiaInducible Factor 1,HIF-1)的低氧反应元件HRE,所以也是HIF-1的靶基因。在发生脑卒中时,机体发生缺血缺氧,此时HIF-1能够作用于BNIP3,使其表达水平上调。BNIP3的功能研究主要集中于两个方面:一方面BNIP3可以促进细胞凋亡或者坏死,起促进死亡的作用,另一方面BNIP3可以引起线粒体自噬,进而促进细胞存活。现在的研究热点越来越倾向于聚焦BNIP3的促存活作用。本研究采用大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型(permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,p MCAO),在MCAO处理不同时间后,观察BNIP3、线粒体自噬相关蛋白的表达变化,分析脑缺血损伤程度与BNIP3表达水平之间的关系,探讨线粒体自噬和BNIP3在缺血性脑卒中发病过程中的可能作用。本研究发现在脑缺血早期线粒体自噬被激活,缺血晚期线粒体自噬被抑制而导致脑损伤加重,在此过程中BNIP3可能发挥重要的调控作用。主要研究结果如下:1.脑缺血不同时间点大鼠脑梗死体积的变化1.1大鼠脑组织TTC染色为进一步评价大鼠p MCAO后的脑损伤情况,我们对p MCAO不同时间点处理的大鼠脑组织进行切片,用TTC染色来确定脑损伤程度。发现0 h(sham)组大鼠无脑梗死发生,其余各组均存在脑梗死区,且随缺血时间(3 h、9 h、24 h)大鼠脑梗死体积逐渐增加,24 h组脑梗死体积到50%以上。2.线粒体形态在脑缺血过程中的改变2.1 p MCAO后不同时间点线粒体自噬自噬体的变化用透射电镜观察p MCAO后不同时间点的线粒体自噬自噬体的形态和结构,0 h(sham)大鼠脑组织中神经细胞的线粒体结构正常,缺血3 h和9 h线粒体多变圆,并可见典型的线粒体自噬情况,线粒体被溶酶体包裹,形成具有双层膜的自噬溶酶体结构;缺血24 h线粒体形态结构受到严重破坏:双层膜结构不完整,嵴消失,线粒体肿胀明显加剧,且多呈空泡化,完全观察不到线粒体自噬结构。3.BNIP3和线粒体自噬相关蛋白在脑缺血中的表达变化3.1 p MCAO后不同时间点BNIP3表达的动态变化为检测p MCAO后不同时间点BNIP3的变化情况,我们收集p MCAO后不同时间点的脑组织进行Western Blot实验。实验结果显示,当p MCAO处理3 h和9 h时BNIP3蛋白表达水平升高,而p MCAO处理24 h时BNIP3表达水平下调,这提示BNIP3在p MCAO后不同时间点有先升后降的特点,其可能在脑缺血早期发挥作用。3.2 p MCAO后不同时间点线粒体自噬相关蛋白的变化我们又进一步检测了p MCAO后不同时间点线粒体自噬相关蛋白的表达变化,结果显示,当p MCAO处理3 h和9 h时自噬上游调控分子Beclin-1表达增加,自噬标记分子LC3-II/I比值升高,接头蛋白P62和线粒体标记蛋白TOM20、HSP60水平下降,提示线粒体自噬被激活;但是,随着缺血时间的延长这些蛋白表达发生了明显改变,脑缺血24 h时Beclin-1表达下调,LC3-II/I比值降低,而P62和TOM20、HSP60水平增加。以上结果提示,在脑缺血早期线粒体自噬被激活,而在脑缺血晚期线粒体自噬受到抑制。综上所述,本研究发现在脑缺血过程中线粒体自噬以及BNIP3的表达变化与脑缺血损伤程度密切相关:线粒体自噬在脑缺血早期被激活,而在脑缺血晚期受到抑制;BNIP3高表达有利于减轻缺血性脑损伤,BNIP3低表达可能会加重其损伤程度。该结果为今后研究BNIP3的潜在的脑保护作用提供了直接证据,同时也为临床治疗缺血性脑损伤疾病提供了新的干预靶点。