目的:一方面,利用网络药理学的手段,对二精丸防治AD的物质基础与作用机制进行虚拟筛选,为后期实验奠定基础;另一方面,利用行为学、形态学、蛋白质组学和细胞实验验证的研究方法,研究二精丸对去卵巢联合D-半乳糖与Aβ_1-40注射所致AD大鼠学习记忆的影响及其物质基础与作用机制,两者相互印证,共同指明二精丸防治AD的物质基础与作用机制。方法:1基于网络药理学二精丸防治AD物质基础与作用机制研究1.1二精丸化合物的获取和筛选通过TCMSP数据库、台湾中医药资料库、中国科学院化学数据库三个数据库、相关文献调研和实验室获取,对二精丸的化学成分进行搜集。为了便于后期分析,将枸杞子和黄精中的化合物统一命名,并利用DS软件中的ADMET Descriptors模块,对所收集到的成分进行类药性筛选。1.2二精丸活性化合物的靶点预测利用PubChem数据库,将所有的化合物都转化为标准的Canonical SMILES格式,将SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction平台,设置属性为“homo sapiens”,预测活性化合物的潜在靶点并根据文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。1.3二精丸防治阿尔茨海默病靶点的搜集以“Alzheimer’s disease”为关键词,通过OMIM、TTD及DiGSeE三个疾病靶点网站搜集阿尔茨海默病的基因,去除重复靶点基因,与上一步获得的靶点进行比对,最终获得二精丸防治阿尔茨海默病的潜在作用靶点。运用UniProt数据库中的UniProtKB搜索功能,限定物种为“Homo sapiens”,统一靶点编码为“Q9Y5N1、Q9BXC0、Q96JD6”格式,对得到的靶点蛋白命名规范化。1.4通路的富集分析将二精丸防治阿尔茨海默病的潜在作用靶点放入Metascape平台,提交后将输入物种和分析物种均选择为“H.sapiens”,设置P<0.01,对二精丸作用靶点进行GO注释分析和通路分析,保存结果,并按照每个条目涉及的靶点数目进行排序,筛选排名靠前的生物过程和通路。1.5构建成分-靶蛋白-信号通路网络以筛选所得化合物、阿尔茨海默病的靶点及靶点所属信号通路作为材料,通过软件Cytoscape 3.2.1,对成分-靶蛋白-信号通路进行网络构建。运用Tools面板下的Network analysis计算相关网络参数。1.6分子对接验证以FDA认证可用于临床治疗AD药物的英文名称为关键词,于GeneCards平台进行检索,以“score”为指标进行排序,获得相关性靠前的靶点并与二精丸防治阿尔茨海默病的潜在作用靶点进行比对,将比对的结果靶点、二精丸的活性成分和五个阳性药利用DISCOVERY STUDIO的CDOCKER模块,进行对接,筛选与候选靶点对接活性至少优于四个阳性对照药的二精丸化合物。2二精丸对去卵巢联合D-半乳糖与Aβ_1-40注射所致AD大鼠学习记忆的药效学评价2.1二精丸质量控制:按照中国药典（2015版）要求对黄精进行葡萄糖含量测定,对枸杞进行葡萄糖、甜菜碱含量测定,通则0832第二法对黄精、枸杞进行水分测定。2.2药物制备:黄精、枸杞各取1400 g,加5倍体积双蒸水浸泡30 min后,煎煮两次,第1次煎煮40 min,第2次煎煮50 min,两次煎煮液滤过后合并,80¹00℃水浴浓缩得药液2333 mL（含生药量1.2 g/mL）,-20℃冰箱保存备用。2.3动物造模、分组及给药:模型组、阳性对照组（多奈哌齐,1.0mg/kg）、二精丸高剂量组（9.0g生药/Kg）、二精丸中剂量组（4.5g生药/Kg）和二精丸低剂量组（2.25g生药/kg）,每组11只,另设12只假手术组。除假手术组外其余各组大鼠均在手术1周后腹腔注射D-半乳糖100mg/kg,每日1次,持续给药7周。手术4周后脑定位注射Aβ_1-4010ug/只。去卵巢手术3周后开始灌胃给药,模型组与假手术组灌胃等量生理盐水,其他各组灌胃相应药物,给药容量为10mL/kg,每日1次,连续给药28天。2.4检测指标:（1）行为学指标:给药第28天后开始用新物体识别实验检测识别指数,Moriss水迷宫法检测其逃避潜伏期和定位航行能力。（2）形态学指标:HE染色观察海马CA1区神经元形态,尼氏染色观察海马CA1区尼氏体分布。（3）病理学指标:免疫组化法检测Aβ_1-40与p-tau⁴⁰⁴蛋白分布。（4）雌激素水平与受体表达:Elisa法检测血清雌激素水平,免疫组化法检测海马CA1区ERβ阳性细胞。（5）二精丸对去卵巢联合D-半乳糖与Aβ_1-40注射所致AD大鼠海马蛋白质组学的影响:对海马组织的蛋白进行提取、还原、烷基化、酶解及LC-MS联用系统检测,并利用PANTHER Classification System数据库对差异蛋白进行GO分析,String数据库构建蛋白互作网络图,KEGG数据库富集信号通路。（6）DA水平及D1受体和酪氨酸羟化酶表达:Elisa法检测血清DA水平,免疫组化法检测CA1区D1受体和酪氨酸羟化酶的表达。3.二精丸防治AD的物质基础研究MTT法检测Aβ_25³5诱导的PC12细胞最佳造模浓度;MTT法检测二精丸单体化合物对Aβ_25³5诱导的PC12细胞AD模型存活率的影响;Fluo-3 AM钙离子检测试剂盒检测二精丸单体化合物对PC12细胞AD模型Ca²⁺水平的影响。结果1基于网络药理学二精丸防治AD物质基础与作用机制研究通过对AD、二精丸成分靶点数据库进行对比,将筛选出的127个靶点进行GO注释和KEGG通路分析,发现生物过程中排名靠前的有突触信号传递、跨突触信号传递、顺行跨突触信号传递;而在细胞组成分析中靠前的主要是树突、轴突、后突触,主要集中在神经元和细胞膜上;分子功能分析主要是磷酸转移酶活性、蛋白激酶活性、氧化还原酶活性;二精丸防治阿尔茨海默病的的靶点共涉及癌症信号通路、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、5-羟色胺能突触、钙离子信号途径等145条通路。将AD阳性药靶点、前期靶点取交集所获得的靶点与二精丸中65个活性成分进行对接,发现二精丸中与蛋白结合性至少优于四个阳性药的活性成分有Polygonatine A、化合物E等20个。2二精丸对去卵巢联合D-半乳糖与Aβ_1-40注射所致AD大鼠学习记忆的药效学评价2.1二精丸质量控制:枸杞子中甜菜碱含量为0.6924%,黄精、枸杞中葡萄糖和水分含量均符合药典要求。2.2检测指标:（1）行为学指标:在Moriss水迷宫实验中,与模型组比,二精丸高、中剂量组从第3天开始逃避潜伏期明显缩短。在空间探索实验中,二精丸高剂量组穿越平台次数较模型组也有明显增加。在新物体识别实验中,与模型组比,高剂量组和阳性药组大鼠新物体识别指数较高。（2）形态学指标:HE染色显示,与假手术组相比,模型组大鼠海马CA1区神经元细胞排列松散紊乱,细胞核染色较深,神经元细胞数量与层数较少;与模型组相比,高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠海马CA1区神经元形态比较完整,排列整齐,无破损,核仁清晰。尼氏染色显示,与假手术组相比,模型组大鼠海马CA1区尼氏小体随着神经元的丢失而减少;与模型组相比,高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠海马CA1区尼氏小体数量多,形态比较完整,排列整齐。（3）病理学指标:与假手术组大鼠相比,模型组大鼠海马CA1区Aβ、p-tau⁴⁰⁴阳性细胞数量显著增多,细胞周围着色较深;与模型组大鼠相比较,阳性药组、高剂量组大鼠海马CA1区Aβ、p-tau⁴⁰⁴阳性细胞数显著减少,细胞着色较浅。（4）雌激素水平与受体表达:与假手术组相比,血清雌激素水平与海马ERβ阳性细胞数量显著减少,胞浆和突起着色较浅;与模型组大鼠相比,阳性药组、高剂量组大鼠的雌激素水平显著升高,阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组ERβ阳性细胞数量显著上升。（5）DA水平及D1受体和酪氨酸羟化酶表达:与假手术组相比,模型组大鼠的DA、D1受体、TH水平显著降低;与模型组相比,阳性药组、高剂量组大鼠的DA水平和TH阳性细胞数显著升高,阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组D1阳性细胞数量显著增加。（6）二精丸对去卵巢联合D-半乳糖与Aβ_1-40注射所致AD大鼠海马蛋白质组学的影响:（1）Protein Discovery软件与SIEVE软件分析结果:结果发现二精丸高、中剂量组大鼠与模型组大鼠相比,共有247多个差异表达蛋白,其中包含微管相关蛋白、热休克蛋白和脑保护相关蛋白等与AD相关的蛋白。（2）GO分析与String分析结果:差异蛋白具有催化活性的差异蛋白有91种、结合功能56种、转运体活性12种等。差异蛋白在细胞分布最多,其次为细胞器,大分子配合物和膜。共有109种差异蛋白参与细胞进程,其次参与代谢过程的95种,刺激反应性的46种等。（3）KEGG数据库信号通路富集化结果:结果显示以上差异蛋白共参与了PI3K-Akt signaling pathway、Alzheimer’s disease等93条信号通路。3二精丸防治AD的物质基础研究3.1二精丸单体化合物对PC12细胞存活率的影响PC12细胞AD模型Aβ_25³5最佳造模浓度为60μmol/L;4’,5-二羟基黄酮、polygonatine A和化合物E的给药剂量梯度均为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L。3.1二精丸单体化合物对Aβ_25³5所致PC12细胞AD模型存活率的影响本实验采用MTT法检测二精丸单体化合物4’,5-二羟基黄酮、polygonatine A和化合物E对Aβ_25³5诱导的PC12细胞AD模型存活率的影响,与模型组比,4’5-二羟基黄酮20、40μmol/L剂量组较模型组存活率有明显增高;Polygonatine A 20、40μmol/L剂量组PC12细胞存活率显著增高（P<0.05）,且细胞存活率与给药浓度成正比;化合物E 20μmol/L剂量组存活率也显著增高（P<0.05）。3.2二精丸单体化合物对Aβ_25³5所致PC12细胞内Ca²⁺的影响Polygonatine A 40μmol/L组、化合物E 20μmol/L组、4’5-二羟基黄酮20μmol/L组可显著增加PC12细胞AD模型内Ca²⁺水平。结论1二精丸可以改善AD大鼠的学习记忆能力。2二精丸可能通过上调大鼠血液中雌激素水平与脑内ERβ细胞数,降低海马CA1区Aβ、p-tau⁴⁰⁴表达,增加TH和DA表达,致使D1阳性细胞数增多,促使Dopaminergic synapse通路中的TH-DA-D1-Gq-PLC-IP3R-CaM-Camk2d蛋白上调,胞内Ca²⁺浓度上升,引起爆发性钙流,进而促进脑内神经突触间传递,改善学习记忆能力,产生防治AD的药理作用。3二精丸防治阿尔茨海默病的活性成分是:邻苯二甲酸二丁酯、丹皮酚、酪氨酸、芹菜素、4’,5-二羟基黄酮、Polygonatine A、化合物E。