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目的：研究血管紧张素Ⅱ和血管紧张素Ⅲ型受体抑制剂氯沙坦对人乳腺癌tdCF-7细胞系体外增殖情况的影响及其机制；研究血管紧张素Ⅱ和血管紧张素Ⅲ型受体抑制剂氯沙坦对人乳腺癌MCF-7细胞系体外抗阿霉素(Adriamycin,ADR)诱导的凋亡情况的影响及其具体机制,为乳腺癌的靶向性治疗提供理论基础和实验依据。
方法：1、将细胞随机分为：对照组,血管紧张素Ⅱ组,氯沙坦+血管紧张素Ⅱ组,LY294002+血管紧张素Ⅱ组。血管紧张素Ⅱ的终浓度为1、10、100、1000nM,氯沙坦和LY294002的终浓度分别为10-5M和50μM,与细胞提前孵育30min后再加入血管紧张素Ⅱ。采用MTT法观察各实验组细胞增殖率的改变。应用流式细胞技术检测各实验组细胞增殖周期的变化。通过Western blotting法检测各实验组细胞内P13K/Akt信号通路分子p-Akt,Akt,GSK3β,Cyclin D1和P27的表达,分析血管紧张素Ⅱ促进乳腺癌细胞增殖作用的机制；2、将细胞随机分为:ADR组,血管紧张素Ⅱ+ADR组,氯沙坦+血管紧张素Ⅱ+ADR组,LY294002+血管紧张素Ⅱ+ADR组,共同培养24h。ADR的终浓度为0.1μM,血管紧张素Ⅱ的终浓度为1、10、100、1000nM,提前与细胞孵育30min后再加入ADR,氯沙坦和LY294002的终浓度分别为10-5M和50μM,分别与细胞提前孵育30min后再加入血管紧张素Ⅱ。应用Hoechst33342/PI染色、DNA Ladder法和流式细胞技术观察各实验组细胞凋亡情况。通过Westernblotting法检测各实验组细胞内P13K/Akt信号通路分子p-Akt、Akt、caspase-9和caspaqse-3的表达,分析血管紧张素Ⅱ诱导的乳腺癌细胞抵抗ADR诱导的细胞凋亡作用的机制。
结果：1、血管紧张素Ⅱ具有显著的促进乳腺癌MCF-7细胞增殖作用,呈剂量-时间依赖性,其中100nM血管紧张素Ⅱ作用细胞24h时,细胞增殖最旺盛,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);氯沙坦和LY294002可以显著抑制血管紧张素Ⅱ的促细胞增殖作用(P<0.01)。流式细胞技术结果显示,100nM血管紧张素Ⅱ作用细胞24h时,S期细胞比例明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),而氯沙坦和LY294002干预组细胞S期比例明显下降,与单用100nM血管紧张素Ⅱ组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。Western blotting结果显示,血管紧张素Ⅱ明显增加细胞内p-Akt的表达,呈剂量-时间依赖性。100nM血管紧张素Ⅱ上调p-Akt的蛋白表达作用最明显,血管紧张素Ⅱ刺激的p-Akt的表达于15min时达高峰,峰值可以持续到6h。氯沙坦和LY294002可以明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的p-Akt的表达。此外,血管紧张素Ⅱ明显上调细胞内GSK3β和Cyclin D1的表达,下调P27的表达,其中100nM血管紧张素Ⅱ的作用最明显。预先应用氯沙坦或LY294002可以明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的GSK3β、Cyelin D1和P27的表达；2、Hoechst33342/PI染色法证实细胞经ADR作用后,细胞呈现出核凝集、核碎裂等典型的细胞凋亡形态改变；而细胞经过血管紧张素Ⅱ预处理后,细胞典型的凋亡形态改变明显减少；但预先应用氯沙坦或LY294002后,细胞又恢复了典型的凋亡形态。DNA Ladder结果显示,ADR作用于细胞24时,DNA琼脂糖凝胶电泳呈现明显的梯状条带,提示有细胞凋亡发生；而在不同浓度的血管紧张素II组,琼脂糖凝胶电泳中弥散条带依次减少甚至消失,提示凋亡明显被抑制；但氯沙坦和LY294002组琼脂糖凝胶电泳梯状条带又明显恢复。流式细胞技术证实细胞经ADR作用后,凋亡比率为30.17±2.17％；用血管紧张素Ⅱ预处理后,细胞凋亡比率依次下降,呈现出明显的抗凋亡作用,其中100nM血管紧张素Ⅱ组凋亡比率降为15.37±2.33％,与ADR组比较差异具有统计学意义(P<0.01),而加入氯沙坦和LY294002后,凋亡比率分别回升到27.50±2.05％和25.57±2.07％,与100nM血管紧张素Ⅱ组比较差异有统计学意义(P<0.01)。Westrnblotting结果显示,血管紧张素Ⅱ明显增加经ADR处理的细胞内p-Akt的表达,100nM血管紧张素Ⅱ上调p-Akt的蛋白表达最明显,血管紧张素Ⅱ刺激的p-Akt的表达于15min达高峰,峰值可以持续到6h。氯沙坦或LY294002可以明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的p-Akt的表达。此外,血管紧张素Ⅱ可以明显抑制ADR诱导的凋亡执行分子caspase-9和caspase-3的裂解,应用氯沙坦和LY294002可以明显解除血管紧张素Ⅱ对caspase-9和caspase-3的抑制作用。
结论：1、血管紧张素Ⅱ具有促进乳腺癌细胞增殖和加速细胞周期进展的作用,其机制可能是通过与血管紧张素Ⅱ1型受体结合,进而激活PI3K/Akt信号通路分子如p-Akt、GSK3β和CyclinD1的表达,抑制P27的表达有关；2、血管紧张素Ⅱ具有抑制ADR诱导的乳腺癌细胞凋亡作用,其机制可能是通过与血管紧张素Ⅱ1型受体结合,进一步激活PI3K/Akt信号通路中p-Akt,并抑制Akt下游凋亡执行分子caspase-9和caspase-3的裂解来实现。