论文部分内容阅读
癫痫(epilepsy，EP)是由多种病因引起的慢性脑部疾病，以脑神经元过度放电所致反复性、发作性、刻板性和短暂性为特征的中枢神经系统功能失常。慢性、反复发作的癫痫既严重的影响了患者自身的日常工作与生活，又给家庭及社会带来了极其沉重的经济负担。现有的药物能控制大部分的癫痫发作，但仍有约25％的癫痫不能有效控制，这部分癫痫称为难治性癫痫，因此进一步明确癫痫的发病机制及寻找新的治疗靶点非常为重要。在真核生物细胞中，有一种具有双层膜结构的细胞器，即线粒体，它是一个在细胞能量代谢，细胞信号转导、细胞氧化应激及凋亡等方面发挥着至关重要作用的调控平台。神经元是生物体内能量代谢需求较为旺盛的细胞，尤其依赖线粒体的功能，所以线粒体近年来成为研究癫痫发病机制的热点。 线粒体在生物体内是一个持续发生的分裂与融合，具有高度运动的细胞器。线粒体融合与分裂二者之间的动态平衡对线粒体的形态变化及功能进行着调控。线粒体融合使线粒体变为长管状网状结构，而线粒体分裂则促使线粒体的网状结构瓦解成片断。在正常条件下，线粒体分裂和融合(统称为线粒体动力学)之间的动态平衡导致线粒体网络状结构和形态不断地发生着的重塑和变化，从而适应不同的生理活动需要。线粒体分裂可以产生新的线粒体，从而在通过自噬清除受损细胞器及促发强应激水平时的细胞凋亡方面发挥着重要作用。 真核细胞内的动力相关蛋白1(dynamin-related protein1，Drp1)是调控线粒体分裂所必需的蛋白，而真核细胞内线粒体分裂蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1)可以通过细胞膜，它能抑制线粒体动力相关蛋白分裂发动蛋白相关GTP酶(DRPs)，并且高效可逆的诱导线粒体融合进一个巢样的结构。研究已经发现了Mdivi-1在急性肾损伤引起的细胞凋亡中有保护作用，它也可保护心肌细胞对缺血再灌注引起的损伤，这些保护作用主要是通过抑制线粒体分裂而实现的。在我们既往研究中已经发现，癫痫发作后线粒体结构功能受损导致神经元对癫痫发作所致损伤更敏感，形成恶性循环。而线粒体融合分裂在维持线粒体不同功能及对抗线粒体损伤方面发挥重要的作用，受损的线粒体可与邻近完整的线粒体融合，并恢复其功能，而严重受损的线粒体将最终通过线粒体自噬被有选择性地清除。因此我们认癫痫神经元损伤的重要因素和始动环节可能与线粒体融合分裂失衡有关。本研究中，我们利用体外细胞癫痫模型，检测Mdivi-1对癫痫发作后线粒体功能和细胞凋亡的影响，探讨Mdivi-1对Sombati细胞模型中海马神经元的保护作用，并通过半胱天冬酶3(caspase-3)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factors,AIF)和凋亡相关物质细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)动态水平的变化，进一步探讨其作用机制。 研究目的 本研究通过无镁细胞外液处理原代大鼠海马神经元，以建立急性癫痫体外细胞模型，并通过观察线粒体分裂蛋白 Drp1、凋亡诱导因子 AIF、半胱天冬酶和细胞凋亡相关因子细胞色素 C的表达水平动态变化，探讨线粒体分裂蛋白抑制剂Mdivi-1对无镁致痫大鼠海马神经元形态的影响、神经元损伤的干预影响，并进一步探讨其可能的作用机制。 材料与方法 取新生24h内的Sprague-Dawley大鼠75%酒精浸泡消毒后，断头取脑，于解剖显微镜下仔细分离出双侧海马组织，进行海马神经元原代培养。倒置相差显微镜下观察海马神经元在培养过程中的形态学变化，并选取培养至14d的神经元细胞，采用免疫细胞化学方法进行神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）神经元纯度鉴定。培养至14d的海马神经元随机分为对照组（CON组）、无镁诱导组、无镁诱导+DMSO组、无镁诱导+Mdivi-1组四组，后三组按照Sombati细胞模型方法，进行无镁细胞外液处理3h后恢复至正常细胞培养液。无镁诱导+DMSO组、无镁诱导+Mdivi-1组在无镁细胞外液处理前40min分别给予二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）(0.1%)和Mdivi-1（17.66 mg/ml）预处理。选取致痫后3h、12h、24h三个时间点，通过硫代巴比妥法和WST-1法分别测定神经元细胞内的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，采用TUNEL法检测神经元损伤和凋亡情况，并检测Drp1表达变化。另选各组细胞提取总蛋白、细胞核及线粒体蛋白，使用Western blot法检测Drp1、caspase-3、AIF和Cyt C表达水平，实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，QT-PCR）法检测Drp1 mRNA水平。 采用SPSS17.0软件对数据行统计学分析，所得数据以均数±标准差表示，采用LSD（Least—Significant Difference)-t检验进行两两比较，采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)对多组间数据进行比较，以α=0.05为显著性水准。 结果 1.细胞形态学特征：开始种植于六孔板培养液内的大鼠海马神经元体积较小，透亮，呈圆形，散在分布。大多数的神经元细胞在培养24h后贴壁，并且有明显的长短不等的突起长出。培养过程中突起不断生长，培养7d时，神经元典型的轴突与树突即可观察到，胞体立体感强，空泡状细胞核，但神经元之间尚未形成突触，一般为单个细胞。10d左右海马神经元间开始形成通过突出形成网状联系。培养14 d左右时神经元胞体最大，轴突、树突清晰可见，细胞间网络密集分布。培养至4w左右时，维持液中开始有大量细胞碎片出现，细胞逐渐开始凋亡。 2.海马神经元纯度鉴定：取培养至14d的海马神经元细胞进行爬片，采用免疫细胞化学方法进行染色，神经元胞体、树突和轴突均被染成棕色，鉴定结果显示：海马神经元纯度达93.1%。 3. Western blot结果：Drp1蛋白表达量在无镁诱导后3h开始升高，24h时达最高水平，与CON组比较差异有统计学意义；无镁诱导+Mdivi-1组、无镁诱导组及无镁诱导+DMSO组三组大鼠海马神经元无镁诱导后24h Drp1蛋白表达水平均显著升高，caspase-3激活、AIF移位及CytC均增加明显，与CON组比较差异有统计学意义；与无镁诱导组相比，无镁诱导+DMSO组Drp1水平升高，无镁诱导+Mdivi-1组Drp1蛋白表达水平降低，差异均无统计学意义；无镁诱导+Mdivi-1组caspase-3激活、AIF移位及Cyt C释放均减少，差异均具有统计学意义，无镁诱导+DMSO组caspase-3激活、AIF移位及Cyt C释放均增多，差异都无统计学意义。 4. QT-PCR结果：无镁诱导+DMSO组、无镁诱导+Mdivi-1组、和无镁诱导组三组大鼠海马神经元无镁诱导后24h Drp1 mRNA表达水平与CON组相比差异有统计学意义，均显著升高；与无镁诱导组相比，无镁诱导+DMSO组Drp1mRNA水平升高，无镁诱导+Mdivi-1组Drp1 mRNA水平降低，差异均没有统计学意义。 结论 1.无镁致痫大鼠海马神经元内Drp1 mRNA及Drp1蛋白表达量均增加，说明癫痫发作的病理损伤过程中可能有神经元线粒体分裂的增加； 2. Mdivi-1可能通过抑制caspase-3的激活、AIF的移位以及Cyt C的释放对无镁致痫大鼠海马神经元起到神经保护作用； 3.本研究为抗癫痫治疗提供了新思路：可以通过抑制线粒体分裂来减少神经元凋亡，起到脑保护作用。