论文部分内容阅读
在中药材的储存、制备等过程中会发生致病菌污染,沙门氏菌是常见的食源性微生物致病菌之一,感染后会导致中毒、呕吐、腹泻等病状,因此对沙门氏菌检测是必要的、严格的,而传统的微生物学检测方法繁琐、灵敏度低,未能达到快速检测需求。因此,利用现代分子生物学技术,提高检测的特异性和灵敏度已经成为人们关注的热点。本实验以沙门氏菌为研究对象,根据国标及文献中沙门氏菌常见毒力基因inv A、fimI、mgtC和fimA,分别设计合成了沙门氏菌毒力基因inv A、fimI、mgtC和fimA的4对引物。提取鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、肠炎沙门氏菌CICC 21482、沙门氏菌CMCC 50956、沙门氏菌CMCC 50957、沙门氏菌CMCC 50958、以及沙门氏菌CMCC 50959的全基因组DNA;以提取的沙门氏菌菌株的全基因组DNA为模板,PCR扩增,分别得到inv A、fimI、mgtC和fimA PCR扩增产物,通过琼脂糖凝胶对目的产物inv A、fimI、mgtC和fimA的分离纯化,并分别将纯化过的目的片段inv A、fimI、mgtC和fimA进行连接与转化,克隆到载体p LB-simple Vector中,构建含inv A、fimI、mgtC和fimA目的片段的重组质粒DNA;利用菌落PCR和测序对重组质粒进行验证,经验证转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存,将其进行冻干制成冻干粉,用于检测沙门氏菌的标准品。结果成功构建出毒力基因inv A、fimI的重组质粒,进行均一性,随机性,稳定性检测,结果表明浓度、纯度和稳定性均达到要求,从而完成对沙门氏菌毒力基因质粒定性标准品的制备。本实验采用来自河南焦作四大怀药,共81批次,其中怀菊花23批,怀山药18批,怀地黄20批,怀牛膝20批,提取81批四大怀药的全基因组DNA,进行PCR扩增,用沙门氏菌常见毒力基因inv A、fimI质粒DNA标准品做阳性对照,以无菌水做阴性对照,用于81批怀药样品的检测,实验结果显示,结果在81批样品中fimI没有被检测出,检出率为0,有2批菊花样品检测出inv A,检出率为8.69%,1批地黄样品中检测出inv A,检出率为5.00%,选择被污染的菊花和地黄样品,用传统微生物检测方法进行检测,样品经过增菌培养后,在选择性显色培养基平板上第8批次地黄样品、第15批次菊花样品不长菌落,第7批次菊花在选择性平板上长出了沙门氏菌的典型菌落形态,选取纯化的单菌落进行PCR扩增16S r RNA送测序比对,从而完成对81批次怀药中沙门氏菌的研究应用。与传统方法相比,PCR检测效率更高,耗时更短。本研究以食源性微生物沙门氏菌为研究对象,构建沙门氏菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品并将其用到中药中进行检测,提供了一种临床上可以应用的技术和质粒标准品,也为临床上溯源提供了帮助。