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青蒿(Artemisia annua L.)是具有悠久历史的中国传统药用植物,青蒿素是治疗疟疾药物中的最有效成分。WHO推荐的青蒿素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)每年可以拯救数十万人的生命。然而,青蒿素在野生型青蒿中的含量极低(0.1-1%叶片干重),因此如何提高青蒿中青蒿素含量就成为青蒿研究领域的热点问题。青蒿素是倍半萜内酯类化合物,主要在青蒿的分泌型腺毛中合成和储存。提高青蒿分泌型腺毛密度和实现青蒿素代谢的转录调控可以作为提高青蒿素含量的重要手段。但目前有关植物腺毛,尤其是分泌型腺毛发育机制研究还很少,对于青蒿中青蒿素合成的转录调控机制研究也还处于初步阶段。MYB类转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,尤以R2R3MYB最为重要。它广泛参与植物对环境的应答、次生代谢产物的合成、组织器官的生长发育以及分生组织增殖等生理生化过程。虽然R2R3MYB类转录因子功能多种多样,但是在青蒿中关于R2R3MYB类转录因子调控腺毛起始和青蒿素代谢的研究还很少。本研究基于青蒿全基因组、青蒿腺毛转录组的数据,以R2R3MYB类转录因子作为切入点,筛选出能够调控青蒿分泌型腺毛起始发育以及青蒿素合成的候选R2R3MYB类转录因子。同时,利用生物信息学、分子生物学、转录组学等研究方法对候选基因的功能进行进一步的验证,取得了以下研究结果:1.克隆并鉴定了青蒿中R2R3MYB类转录因子AaMIXTA1,发现AaMIXTA1能够正向调控分泌型腺毛密度和叶片表面角质层的合成。首先通过生物信息学及共表达分析,得到了一个R2R3MYB第9亚家族蛋白基因AaMIXTA1。对AaMIXTA1进行表达部位分析,发现其在分泌型腺毛的两个基细胞中优势表达。转基因青蒿实验结果显示,在OE-AaMIXTA1转基因植株中,青蒿叶片表面分泌型腺毛密度显著上升,同时青蒿素含量也显著上升;而在AaMIXTA1-EAR转基因植株中分泌型腺毛密度显著下降,且青蒿素含量也显著下降。由此证明AaMIXTA1正向调控青蒿分泌型腺毛的起始,也表明通过调节腺毛密度来调节青蒿素的含量切实可行。此外,在OE-AaMIXTA1转基因青蒿植株中角质层的积累显著高于对照植株;相反,AaMIXTA1-RNAi转基因青蒿植株角质层的积累则显著低于对照植株。通过分析AaMIXTA1-RNAi转基因植株转录组测序数据发现,AaMIXTA1-RNAi转基因青蒿植株中叶片表面的角质层合成酶基因的表达显著下降,如AaCYP86A1、AaCYP77A1、AaCER1、AaKCS5、AaABCG12等。Dual-LUC实验结果表明AaMIXTA1可以激活上述基因的表达。上述结果表明AaMIXTA1能够正向调控青蒿分泌型腺毛密度和叶片表面角质层的合成,该研究对深入阐明植物分泌型腺毛发育起始和叶片角质层的合成调控机制具有重要意义。2.克隆并鉴定了青蒿中R2R3MYB类转录因子AaMYB3和AaMYB6,发现AaMYB3可以负向调控青蒿素合成,而AaMYB6可以正向调控青蒿素合成。基于青蒿腺毛转录组数据,利用共表达分析筛选得到两个调控青蒿素合成的R2R3MYB类转录因子,分别命名为AaMYB3和AaMYB6。首先,AaMYB3是在青蒿腺毛中优势表达的青蒿素合成的负向调控因子,并且可以负向响应MeJA。在AaMYB3-OE的转基因青蒿植株中,青蒿素合成途径基因的表达显著降低,青蒿素的含量也显著降低;在AaMYB3-Anti的转基因青蒿植株中,青蒿素合成途径基因的表达都显著提高,青蒿素的含量也显著提高;而在AaMYB3-EAR的转基因青蒿植株中没有检测到青蒿素。酵母实验结果表明AaMYB3可以与AaSPL9和AaTPL相互作用。此外,AaMYB6是在青蒿分泌型腺毛中特异表达的青蒿素合成的正向调控因子,并且可以正向响应MeJA。在AaMYB6-OE的转基因青蒿植株中,青蒿素合成途径基因的表达显著上调,青蒿素的含量也显著上调;而在AaMYB6-Anti、AaMYB6-EAR的转基因青蒿植株中,青蒿素合成途径基因的表达显著下调,青蒿素的含量也显著下调。酵母实验结果表明AaMYB6可以与AaSPL9和AaERF2相互作用。上述实验结果表明AaMYB3和AaMYB6分别是青蒿素合成的负向和正向调控因子,本研究提出了可能存在的以形成MYB-SPL-ERF复合体为基础的新的次生代谢调控模型。