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肝细胞癌是我国致死率居第二位的恶性肿瘤，侵袭力强，易转移，预后差。尽管人们做出巨大努力，但对其发病机制仍了解不多。在亚洲乙肝病毒感染是HCC的最主要相关因素。AFP是目前唯一的HCC诊断标志物，但是特异性和敏感性都有不足。大约有25％的HCC病人AFP阴性，急需发展新的肿瘤标志物。Annexin家族是一种结构高度保守的钙依赖磷脂结合蛋白，几乎参与所有的膜事件。很多研究表明annexin表达的改变和肿瘤发生发展相关，但在HCC中只报道了三个annexin表达的变化。考虑到它的保守性，我们用实时定量PCR技术系统调查了所有12个annexin成员和AFP在肝癌、癌旁组织及7种常见HCC细胞系中mRNA的表达。以期了解annexins家族整体和HCC的关联以及作为HCC生物标志物的可能。结果表明annexin在肿瘤组织和癌旁组织中的表达有很好的相关性；5个在肿瘤中表达显著上调，2个显著下降，部分结果得到免疫组化验证；多个基因的表达显著相关。聚类分析提示联合检测AFP和多个annexin表达水平可能有助于提高HCC的预测能力。另外细胞系HepG2和PLC／PRF／5具有和肿瘤组织相似的表达谱，可以作为研究annexin在HCC中生物学功能的细胞模型。CTL是清除病毒、肿瘤和外源移植物的主要效应细胞，了解CTL的数量和功能状态有重要意义。四聚体染色技术是目前最灵敏和便捷的抗原特异性CTL定量检测方法，是研究病毒CTL表位的重要工具。常规的四聚体制备方法是利用基因工程在MHC重链HLA分子胞外区C端连上15氨基酸的BSP得到重组HLA-BSP分子，分别以包涵体形式表达MHC轻链β2 m和HLA-BSP，在HLA限制性表位肽存在下重折叠得到MHC-肽复合物，生物素化后利用亲合素和生物素的特异性结合，用荧光标记的亲合素螯合四个复合物分子而得到可用流式细胞仪检测的四聚体。因为CTL识别抗原有MHC限制性，而HLA是人类多态性最丰富的基因座，当针对不同人群需要频繁构建含不同HLA的MHC复合物时，这种方法暴露出很大的缺点。由于HLA基因的胞外区两端GC含量很高，加上附带长序列的影响，需要巢式PCR的方法才能从反转录产物中克隆得到重组HLA-BSP。而且需要分别表达纯化两种包涵体蛋白，分别加入重折叠缓冲液，操作繁琐，重折叠效率较低。我们根据融合蛋白linker的设计原理，结合中国人群出现频率最高的13种HLAⅠ等位基因的结构特点，设计了一种用于Ⅰ型四聚体构建的通用单链重组人MHC原核表达系统，提高了构建重组MHC分子的效率。分别用一段3’端含酶切位点的柔性多肽linker编码序列连接β2m和HLA，一段5’端含酶切位点的linker编码序列连接HLA和BSP，两种酶切位点不存在于中国人群出现频率最高的13种HLAⅠ等位基因和β2m中。构建四聚体的通用部分β2m和BSP可以被固定在原核表达载体上，当需要更换不同HLA等位基因时，可以一步从反转录产物中克隆到HLA胞外区，通过简单的酶切连接反应即可得到重组MHC。并且单链MHC分子的表达、纯化和重折叠工作量都大大减少。经常规方法构建的四聚体检测对照，验证了这一设计的有效性。乙肝病毒感染是HCC发生最重要的相关因素。HBX为病毒基因组转录所必需，并能够抑制细胞调亡，改变细胞周期，抑制DNA修复，削弱细胞间粘附，被认为是重要的致癌因子。研究表明HBX在慢性乙肝病人中的检出率高于其它乙肝抗原，而在HCC病人中检出率高于80％，可以认为HBX是乙肝病毒阳性HCC的肿瘤特异性抗原。由于HCC的发展迅速，恶性程度高，除了部分病人可以早期手术外没有很好的治疗手段。如果HBX能诱导特异性CTL，则可以通过过继免疫或表位疫苗策略达到治疗HCC的目的。为了覆盖最大人群，我们选择报道的8株中国人群流行的HBV基因型，和中国人群出现频率最高的HLA A0201基因型，通过计算机筛选得到四个潜在的HLA A0201限制的存在于所有入选基因型的X蛋白CTL表位，经过体内外生物学功能实验验证，其中HBX115-123（CLFKDWEEL）能诱导出特异的CTL。在此基础上，我们构建含该表位及HBC18-27的四聚体检测了4例HLA-A2+慢性活动性乙肝病人和6例感染HBV的HLA-A2+肝癌病人外周血中相应特异性CTL的数量。结果在所有病人外周血中检出HBC特异性CTL；在所有慢性活动性乙肝病人和4例肝癌病人外周血中检出HBX特异性CTL，但数量少于HBC特异性CTL；肝癌病人外周血中测出的两种特异性CTL数量均少于慢性活动性乙肝病人外周血中相应CTL数量。提示肝癌病人多处于免疫抑制状态，HBX的免疫原性相比HBC弱，可能HLAA0201限制性HBX表位不是免疫优势表位，但HCC病人体内确实存在HBX特异的CTL。HBX特异的CTL能否发展成为HCC免疫治疗手段需进一步研究。