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研究背景:随着生活质量的提高,人类西方化的饮食结构中脂肪类摄入比例已高达40%,大量临床研究发现,高脂饮食在引发肥胖和脂代谢紊乱的同时,对男性精子质量也会造成影响,主要表现为精子数量及活力下降、染色体受损以及精子形态异常。有研究表明高脂饮食会改变人体内肠道微生物的组成,进而打破肠道微生物的生态平衡。肠道微生物在宿主的营养吸收、肠道与免疫系统的功能、脂肪代谢、能量供应等诸多重要生理过程中发挥作用。肠道菌群组成的变化与肥胖、代谢综合征、癌症、神经系统退行性疾病的等的发生、发展和治疗密切相关。然而,肠道菌群组成的变化是否会影响精子质量尚不明确。因此,我们应用C57BL/6雄鼠模型以及临床不育男性的样品进行了以下研究:研究目的:研究高脂饮食诱导的肠道菌群失衡对雄性小鼠精子质量影响及相关机制。研究方法:1.动物研究:(1)肠道菌群失衡供体雄鼠模型的构建:在实验的全过程中,分别给予供体雄鼠正常饮食(Normal Diet,ND)和高脂饮食(High-fat Diet,HFD),构建ND、HFD肠道菌群供体模型;(2)肠道菌群受体雄鼠模型的构建:通过肠道菌群替代实验(Fecal microbiota transplantation,FMT),将 ND、HFD 肠道菌群供体雄鼠的肠道微生物分别转移到正常饮食的受体雄鼠胃肠道内,建立正常菌群受体(ND-FMT)和高脂菌群受体(HFD-FMT)模型鼠。肠道菌群替代实验每隔一天进行一次,持续15周至造模结束;(3)对肠道菌群供体组雄鼠进行精子活力和数量的检测,并提取盲肠粪便DNA进行16S-rDNA测序,检测肠道菌群组成的变化;(4)对肠道菌群受体组雄鼠生殖状态进行实验分析:通过精子动力分析仪检测雄鼠精子数量和活力的变化;使用Elisa试剂盒检测血清中雄性激素和内毒素的水平;利用病理组织染色研究方法观察雄鼠睾丸组织的形态学变化;对睾丸组织进行转录组测序,研究肠道菌群失衡对宿主的睾丸组织中基因表达水平变化的影响;利用实时荧光定量PCR技术(Real-Time PCR,RT-PCR)对附睾组织的炎症情况进行检测;(5)检测ND-FMT和HFD-FMT组小肠组织的健康状况:利用病理组织染色、免疫组织化学和免疫荧光化学的方法检测小肠中的炎症情况和相关蛋白的表达变化;(6)提取盲肠粪便DNA进行16S-rDNA测序,对肠道菌群组成及功能的变化进行研究;(7)利用液质联用色谱仪分析检测粪便和血清中代谢产物的变化。2.临床研究:(1)收集健康男性及少精子症、弱精子症、畸型精子症男性的精液,对其精子质量及精液中内毒素的水平进行检测;(2)收集健康男性及少精子症、弱精子症、畸型精子症男性的血浆,对血浆中内毒素的水平进行检测;(3)收集健康男性及少精子症、弱精子症、畸型精子症男性的粪便样本,提取粪便中微生物的DNA进行16s-rDNA测序,对样本内的肠道微生物结构和组成进行检测。研究结果:(1)肠道菌群供体组中,与ND相比,食用高脂饮食的HFD雄鼠的精子活力显著下降,精子数量减少,肠道微生物的结构和组成发生显著变化;(2)肠道菌群受体组中,与ND-FMT组小鼠相比,接受HFD小鼠肠道微生物移植的HFD-FMT组雄鼠的精子活力、精子数量显著下降,血液中内毒素水平、卵泡刺激素水平上升。病理组织染色结果和RT-PCR相对定量检测结果显示HFD-FMT组小鼠睾丸组织生精细胞(圆形精子、长形精子、精母细胞)减少。睾丸转录组测序结果显示,与ND-FMT组相比,在HFD-FMT组中有583个基因表达下调2倍以上,133个基因表达上调2倍以上;与ND-FMT组相比,HFD-FMT组附睾组织中炎症因子,如单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,Mcp1)、白介素 1b(Interleukin 1b,Il1b)、趋化因子 10(C-X-C motifchemokine 10,Cxcl10)水平显著升高;(3)小鼠16S-rDNA的测序结果显示,ND-FMT和HFD-FMT两组小鼠的肠道菌群中拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃菌属(Prevotella)、Rikenella菌属、乳酸菌属(Lactobacillus)、AF12菌属的丰富度存在显著差异;(4)与ND-FMT组小鼠相比,接受NFD小鼠肠道微生物移植的HFD-FMT组雄鼠的小肠内有淋巴细胞和巨噬细胞的浸润,伴随Toll样受体4(Toll-like receptor 4,Tlr4)、髓样分化因子 88(Myeloid differentiation primary response 88,Myd88)表达水平升高;(5)与ND-FMT组相比,在HFD-FMT组粪便中组胺、皮质酮、左炔诺孕酮含量上升,血清中亚精胺含量下降;(6)在临床样本中,拟杆菌属(Bacteroides)和普雷沃氏菌属(Prevotella)的总丰度与精子活力显著负相关,血液中内毒素水平与拟杆菌属(Bacreroides)的丰度显著正相关;(7)在临床样本中,当Prevotella Copri(P.copri)含量低于3%时不会对精子质量产生影响,而当其在体内含量异常增多(>15%)时与精子活力呈显著负相关。研究结论:高脂饮食诱导的肠道菌群失衡会通过引发肠道炎症、内毒素血症和附睾炎症导致小鼠精子质量下降。为未来通过重建肠道菌群平衡以干预临床少弱畸精症的病人提供了一定的理论基础。