目的 乙型肝炎病毒（HBV）基因组具有很高的变异性，许多HBV携带者个体内都存在不同的HBV基因株（即多样性或异质性），不同株的病毒复制水平、免疫原性和传播特点等均不同，对疾病的发展和转归的影响也不同。为清晰的了解HBV基因在母婴体内异质性的具体状况，探索HBV基因变异与宫内传播的关系，本研究建立了乙型肝炎全长聚合酶链反应（Full-length PCR），可以直接从血清中一次克隆HBV全基因，在此基础上，对HBsAg阳性孕妇及其新生儿体内HBV前S/S基因进行了序列分析。 方法①2000年1月至6月收集西京医院检验科检测HBV DNA阳性的乙型肝炎患者血清10例，提取HBV DNA后，建立全长聚合酶链反应，并进行PCR条件优化。 ②PCR产物回收纯化后克隆入载体，获得HBV全长基因克隆，同时用PCR、酶切及测序三种方法对其进行鉴定。 ③1997～1998年，由王素萍博士收集太原市传染病院妇产科HBsAg阳性足月分娩产妇静脉血及其新生儿出生后24小时内股静脉血共50对，用新建立的HBV全长扩增方法成功扩增HBsAg阳性孕妇HBV DNA共8例，其中发生宫内传播者4例，未发生宫内传播者4例，并获得HBV全长基因克隆，然后对其前S/S区扩增并测序，其序列分析采用MEGLINE和VECTER NTI软件。 ④从2例新生儿血清标本中提取HBV DNA，对其进行HBV前S/S区基因扩 ＄·ftLt4＋WI 增并测序，结果与其母亲、其它HBsAg阳性孕妇以及临床普通乙肝患者体内 HBV基因的相应区段序列进行同源性比较分析。 结果：①HBV全长聚合酶链反应的建立：经全长peR ＆41L优化，PCR反应体 系为：10XBuffer 4．snl，25InM MgCI。3ul，10filM dNTP Inl，引物 PI、PZ 各 30PM，模板 5 PI，无菌水至 45卜 l，石蜡油 3滴封顶，经热启动（KR反应混 合物加热至 85C后，加入酶反应混合物 5 ul，包括 Taq／e。DNA混合酶 2．6u， 10 X Buffer 0．5 ul，无苗水）进人 KR循环；PCR反应参数：94℃ 45秒，60’C 1分钟，72’C 4分钟（每循环自动增加延伸时间5秒），40个循环后，72C延伸 10分钟。用新建立的全长基因扩增方法，对10份新鲜乙型肝炎患者血清标本扩 增后，3份出现了 3．Zkb的扩增片段，且该 3份样本均为 HBsAs、HBeAe、nt i－HBc 全阳性，同时以质粒为模板的扩增全部出现了目的扩增产物的核酸带。以相同样 本用该方法多次重复扩增，结果全长PCR目的产物带清晰，重复性稳定。获得的 HBV重组质粒用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定，均证明所获重组质粒为全长一HBV重组质粒。②用全长HBV扩增方法获得8例HBsAg阳性孕妇体内HBV全长 基因克隆，其中发生宫内传播和未发生宫内传播的孕妇各4例，每例选取5个全 长克隆，对其前S亿基因进行测序及序列分析。结果显示，所测克隆的核昔酸序 列均属于HBV C基因型。发生宫内传播的HBSAg阳性孕妇的20个克隆中碱基平 均替代率为3．she、缺失率为0．7be、插入率为二．21咒未发生宫内传播的HBsAs 阳性孕妇的20个克隆中碱基替代率为2．27％，缺失率为0 Zbe，插人率为0．26％， 三种突变模式中以替代最为常见。对两类各20个克隆的碱基平均突变率做／检 验，f值为 11，Pm．001，有较为显著的差异。HBV前 S乃区各克隆间的核昔酸 变异亦显示，发生宫内传括的HBSAg阳性孕妇体内5个克隆间核昔酸变异较大。 对两类HBsAg阳性孕妇每例5个克隆间的平均同源性作t检验，t值为2．92， P＜0．05，有统计学意义。③对2份HBsAg阳性新生）L血清HBV DNA前S／S区进 行扩增并测序。所测序列与己获得的其HBSAg阳性母亲5株全长基因的相应区段 序列同源性比较，结果分别为88．6～99．9％，93．2～99．W；与其它HBsAg阳性 二 O＠罕呕大o颀士讼大孕妇体内HBV全长基因相应区段序列同源性比较，结果分别为79．9～92．h、80S～90．化：与3例临床普通乙肝患者体内HB V全长基因中5基因的7835p相应区段序列同源性比较，结果分别为84．l～92．6兄85．6～gi．乃。 结论：①HBV全长聚合酶链反应目的产物带清晰，重复性稳定，所获HBV全长克隆经PCR、酶切、测序三种方法鉴定，均证实为HBV全长克隆、表明HBV全长基因扩增技术的建立是成功的，但这种方法更适用于对高拷贝模板的扩增。②发生宫内传播的孕妇较未发生宫内传播的孕妇体内 HBV前S乃区基因异质性高，碱基突变率亦显著增高，说明孕妇体内HBV基因异质性增高可能较易发生宫内传播。③新生儿体内HBV前S店基因与其HBSAg阳性母亲体内全长基因相应区段序列?