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研究背景沙眼衣原体引起的细菌性性传播疾病目前是国内外重要的公共卫生问题,在其他性传播疾病渐渐得到的控制的情况下,生殖道沙眼衣原体感染的发病率却持续走高。鉴于目前因沙眼衣原体耐药导致治疗失败的案例越来越多,抗生素已经无法控制它的发展,我们迫切的需要一个强有的治疗措施以改善沙眼衣原体感染和流行的现况。衣原体噬菌体被公认为最有希望解决这一难题的有效措施。研究目的1.拟获得对沙眼衣原体有高效抑制或破坏作用的、特异的、安全的重组噬菌体。为临床上沙眼衣原体感染的精准治疗方法奠定基础。2.初步探究重组噬菌体对沙眼衣原体的可能作用机制。研究方法1.重组M13-RGD-IN5噬菌体对沙眼衣原体作用及机制:（1）利用基因工程构建重组噬菌体M13-RGD-IN5、M13-RGD、M13-IN5,即将整合素RGD和衣原体噬菌体PhiCPG1的IN5分别插入到M13噬菌体的主要外壳蛋白pVIII和次要外壳蛋白pIII中;（2）纯化重组M13噬菌体并用噬菌斑法测试各重组M13噬菌体的滴度;（3）CCK-8实验检测重组M13噬菌体对Hela细胞的细胞毒性并筛选出重组噬菌体最适干预浓度;（4）将不同的重组M13噬菌体作用与沙眼衣原体（CT）和豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）,通过免疫荧光检测观察重组噬菌体对Hela细胞、沙眼衣原体及豚鼠结膜炎衣原体的作用;（5）通过共聚焦显微镜观察重组M13-RGD-IN5噬菌体在感染有沙眼衣原体的hela细胞中的定位;（6）探究透射电子显微镜观察重组M13-RGD-IN5噬菌体感染沙眼衣原体36小时后,沙眼衣原体在你超微结构上的变化;（7）利用针对IN5的多克隆抗体检测重组M13-RGD-IN5对沙眼衣原体作用的特异性;（8）通过QPCR验证重组噬菌体是否可在沙眼衣原体中增殖。2.重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体作用及机制:（1）利用基因工程构建重组pGFP-PhiCPG1质粒;（2）利用CaCl2法将重组质粒转化进入豚鼠结膜炎衣原体的原体（EB）中;（3）通过传代扩增重组pGFP-PhiCPG1噬菌体,并通过QPCR对每代重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的拷贝数进行定量;（4）纯化重组pGFP-PhiCPG1噬菌体,并用QPCR定量;（5）CCK-8实验检测重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对Hela细胞的细胞毒性;（6）将不同浓度的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体作用沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体,用免疫荧光检测观察重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对衣原体的作用并筛选出最佳干预浓度;（7）将最适干预浓度的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体作用于沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体后,利用免疫荧光观察感染后不同时间段重组噬菌体对衣原体的作用;（8）透射电子显微镜观察重组噬菌体感染衣原体36小时后,沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体在超微结构上的变化。研究结果1.重组M13-RGD-IN5噬菌体:（1）成功构建了重组M13-RGD-IN5噬菌体、重组M13-RGD噬菌体、重组M13-IN5噬菌体;（2）根据CCK-8实验检测结果,证明重组M13噬菌体的滴度在小于等于10100 pfu/mL时对HeLa细胞没有明显的细胞毒性;（3）RGD的加入使得细胞的内吞作用增强具有剂量依赖性;IN5的加入不影响Hela细胞对重组M13-RGD-IN5噬菌体的摄取;（4）重组M13-RGD-IN5噬菌体对沙眼衣原体的抑制作用具有剂量依赖性并选取109 pfu/ml为最佳干预浓度;（5）重组噬菌体显著降低沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体的感染,抑制率分别为69.05%和77.06%;（6）重组M13-RGD-IN5噬菌体,能穿透细胞粘膜屏障及包涵体膜进入到沙眼衣原体在宿主细胞形成的包涵体中,而这种现象未出现在重组M13-RGD噬菌体干预沙眼衣原体的过程中;（7）若重组噬菌体在感染沙眼衣原体之前,将其与抗IN5的多克隆抗体共同孵育,则不会改变沙眼衣原体的感染进程;（8）透射电镜观察结果显示重组M13-RGD-IN5噬菌体影响沙眼衣原体网状体（RB）向原体（EB）的正常转化,产生异常增大的网状体从而抑制EB的产生;（9）QPCR结果显示,重组M13-RGD-IN5噬菌体在沙眼衣原体及Hela细胞中是不增殖的,遵守严格的宿主限定。2.重组pGFP-PhiCPG1噬菌体:（1）成功构建出重组pGFP-PhiCPG1噬菌体;（2）pGFP的加入并不影响PhiCPG1在豚鼠结膜炎衣原体中的自我包装,感染与增殖过程;（3）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1可以感染沙眼衣原体;（4）CCK-8实验检测结果,证明重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的滴度在小于1016v.g/mL时对HeLa细胞没有明显的细胞毒性;（5）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1对沙眼衣原体及GPIC有显著地抑制作用且有剂量依赖性;（6）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1对沙眼衣原体及GPIC在感染早期无明显影响,抑制作用主要发生在衣原体生长周期的中后期,影响RB向EB的正常转化,产生异常增大的网状体从而抑制EB的产生。研究结论1.通过基因工程合成的能稳定表达整合素结合蛋白RGD和衣原体噬菌体衣壳蛋白IN5的重组M13-RGD-IN5噬菌体克服了细胞膜及所作用粘膜的阻碍,对沙眼衣原体的生长具有明显的抑制作用,且不影响其自身的蛋白折叠。2.通过基因工程构建的重组噬菌体pGFP-PhiCPG1生物学特性与衣原体噬菌体PhiCPG1极为相似,适用于在实验研究衣原体噬菌体PhiCPG1;能感染沙眼衣原体并能明显抑制其生长繁殖。3.重组噬菌体M13-RGD-IN5抑制沙眼衣原体的感染的机制可能是信号通路触发的破坏作用。重组噬菌体pGFP-PhiCPG1抑制沙眼衣原体的感染的机制除了噬菌体大量增殖造成的机械破坏外,可能还存在信号通路触发的某种破坏作用。4.综合整个结果,暗示沙眼衣原体有可能是衣原体噬菌体PhiCPG1的宿主菌之一或者沙眼衣原体可能存在自己的噬菌体而且与噬菌体PhiCPG1的亲缘关系很近,为寻找沙眼衣原体特异性噬菌体提供了方向。