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鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤之一，在头颈部恶性肿瘤中占首位。鼻咽癌原发部位隐蔽，不易观察，且与鼻腔、鼻窦和颅内相毗邻，所以临床症状出现较晚而且各异；鼻咽癌也是头颈肿瘤中转移率最高的。这些都导致了鼻咽癌常常容易被误诊或漏诊，影响治疗效果。鼻咽癌的发病人群以40～50岁的青壮年多见，一旦发病对社会、经济和家庭造成较大影响。因此，鼻咽癌的早期诊断和治疗的研究一直是我国耳鼻咽喉—头颈外科学研究的重点之一。目前鼻咽癌的治疗还是以放射治疗为主。对放疗不敏感、放疗后复发以及中晚期的患者，可采取化学药物治疗，但这只是辅助性治疗或姑息性治疗。鼻咽癌的手术治疗也只在一些特殊情况下作为辅助方法采用。除了以上三种常规治疗，近年来也有作者尝试应用光动力疗法和微波热疗治疗鼻咽癌，但也只能作为辅助手段。重组DNA技术的发展使肿瘤的基因治疗成为可能。根据肿瘤发生机理制定的基因治疗方案已成为肿瘤治疗的热点。早期研究者主要运用反义核酸技术干预肿瘤相关基因的表达，取得了一定效果。近年来，RNA干扰技术在哺乳动物体内的应用，更为肿瘤的基因治疗开辟了一个新的视野。目前应用于肿瘤基因治疗的RNA干扰技术大多是以非编码的小干扰RNA（siRNA）为效应分子。对另一种非编码RNA——microRNA（miRNA）的应用研究才刚刚起步。miRNA是机体内源性的RNA干扰触发器，它们可以通过在经典的RNA干扰途径降解靶基因mRNA、也可以直接抑制靶基因的蛋白翻译、还可以通过快速脱腺苷化降解mRNA。miRNA已经被看作生物体内固有的基因调控子中最大的一个家族。本研究的目的是模拟天然miRNA构建表达miRNA前体的质粒，实现调控肿瘤相关基因——人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因和血管内皮生长因子（VEGF）基因的表达，开展对鼻咽癌的基因治疗研究。整个研究内容分三部分进行：第一部分调控目标基因的miRNA表达质粒的构建和有效质粒筛选。目的是确定针对hTERT和VEGF基因的miRNA的有效作用位点，观察构建的候选质粒对鼻咽癌中两个靶基因的调控效应，为后续的体外和体内实验奠定基础。结果针对hTERT和VEGF基因分别构建了3个质粒，每个基因各筛选出了1个有效质粒，分别是：pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR-hT2035、pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR-V1025；并确定了2035～2055为hTERT的有效作用位点，1025～1045为VEGF基因的有效作用位点；将两个有效质粒瞬时转染CNE-2细胞后，应用实时荧光定量RT-PCR观察到miRNA使hTERT和VEGF基因的mRNA水平分别下调为77.3％和79.3％；应用Westernblotting观察到两个基因的蛋白表达分别下调73.2％和80.2％；应用CCK-8细胞增殖抑制实验和流式细胞术发现：miRNA对hTERT基因的调控还可以使肿瘤细胞增殖受到抑制，最高抑制率可达到51.1％，细胞周期受阻于G0～G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。第二部分观察调控hTERT和VEGF的miRNA表达质粒对CNE-2细胞的抑制作用。首先利用第一部分筛选出的两个有效的miRNA重组质粒，构建了能够同时调控hTERT和VEGF两个基因的质粒，即pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR-hTERT-VEGF。将该质粒和第一部分获得的两个质粒以及阴性质粒分别转染CNE-2细胞株，经抗生素筛选后成功建立4种稳定表达miRNA质粒的CNE-2细胞株。应用实时荧光定量RT-PCR和Westernblotting观测到调控hTERT表达的质粒和同时调控两个基因的质粒分别下调hTERT的mRNA达87.6％和89.1％，下调蛋白水平达89.4％和80.5％；观测到调控VEGF的质粒和同时调控两个基因的质粒分别下调VEGF的mRNA水平达83.7％和87.5％，下调蛋白水平达87.7％和81.6％。软琼脂集落实验证实靶向hTERT的质粒和同时靶向两个基因的质粒都能够抑制CNE-2细胞的集落形成能力。第三部分裸鼠体内实验。将第二部分获得的4种稳定表达具有调控作用的miRNA质粒的CNE-2细胞株和野生型CNE-2细胞株，分别注入裸鼠皮下，成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。通过绘制肿瘤生长曲线、计算肿瘤抑制率以及免疫组化等方法，观察体内实验的效果。结果发现调控hTERT、VEGF和同时调控两个基因的3种质粒对裸鼠移植瘤生长抑制率分别为64.8％、68.3％、69.2％。本研究最后得到以下结论：（1）成功构建了调控hTERT和VEGF基因表达的microRNA质粒载体，并筛选出有效下调目标基因表达水平的miRNA质粒；hTERT基因位点2035～2055、VEGF基因位点1025～1045是microRNA调控的有效作用位点。（2）体外实验发现，miRNA表达质粒能够有效调控hTERT和VEGF基因的表达，使其mRNA和蛋白表达均下调；对hTERT的调控还可抑制CNE-2细胞的集落形成能力。（3）成功构建了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型；并发现用于调控hTERT表达、调控VEGF表达和同时调控hTERT和VEGF表达的三种miRNA重组质粒都能有效抑制肿瘤生长，为进一步的临床研究打下了基础。