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目的：研究去甲斑蝥素对胆管癌RBE-TCHU179细胞的凋亡、凋亡相关蛋白、细胞周期、细胞骨架、超微结构的影响，探讨去甲斑蝥素对胆管癌RBE细胞的作用及其机制。方法：1MTT实验：将对数生长期细胞种于96孔板中，待贴壁后加入200μl含0、5、10、20、40μg/ml浓度去甲斑蝥素的RPMI1640培养基，分别培养24、48、72小时。后每孔加入MTT工作溶液，温箱中作用4小时，用150μl DMSO溶解结晶，在酶标仪上读取吸光度值。实验重复3次。2流式细胞仪检测凋亡率检测：收集24小时同上浓度实验组及阴性对照组细胞，PBS洗涤3遍后重悬于Binding Buffer中，先后加入AnnexinV-FITC及PI，于流式细胞仪上检测。3流式细胞仪分析细胞周期分布：对数期生长的RBE细胞应用同上浓度的去甲斑蝥素干预24小时，收集并固定于预冷的70%乙醇中，4℃过夜，离心去除乙醇，PBS洗涤后加入PI染色，于流式细胞仪上机测试。4瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态：RBE细胞种于六孔板中，加入不同浓度去甲斑蝥素的培养基中培养24小时。瑞氏-姬姆萨染料固定后加入蒸馏水染色，立即在油镜下观察。5AO/EB染色法观察细胞凋亡及形态：细胞以上述同样的方式处理后，盖在AO/EB染液中染色，荧光显微镜下观察。6Western blot检测bax、Actived-caspase-3和细胞色素c表达：细胞经过去甲斑蝥素作用24小时，收集后提取总蛋白或胞浆蛋白，经过分离、转膜、封闭、一抗、漂洗、荧光二抗、漂洗后上机扫描。7免疫组化染色观察α-Tubulin分布变化：RBE细胞同上分组去甲斑蝥素处理，固定，滴加一抗、孵育、滴加二抗、增强显色、DAB显色，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。8Real-time PCR检测mRNA转录水平：收集去甲斑蝥素作用24小时后细胞，提取总RNA，合成cDNA。bax、bcl-2、Caspase-3及内参β-actin按各自反应体系配比，于荧光PCR仪检测。9扫描电镜观察去甲斑蝥素诱导RBE细胞膜表面超微结构变化：RBE细胞经去甲斑蝥素作用12小时、戊二醛固定、脱水、真空干燥、镀金后于扫描电子显微镜观察。10透射电镜观察去甲斑蝥素诱导RBE细胞超微结构变化：RBE细胞经去甲斑蝥素干预12小时，收集细胞团块经戊二醛固定、锇酸固定、丙酮梯度脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂包埋、聚合、超薄切片、醋酸双氧铀-枸橼酸铅染色，透射电镜观察。结果：1MTT实验显示去甲斑蝥素对胆管癌细胞生长呈抑制作用，不同浓度去甲斑蝥素不同时间作用于胆管癌RBE细胞，其抑制率呈时间—剂量依赖关系（P＜0.05），非线性拟合计算出24小时的IC50值为36.9μg/ml。2Annexin V-FITC/PI双染法显示去甲斑蝥素作用24小时后，RBE细胞均出现了明显的早期凋亡，并在剂量升高后，晚期凋亡所占比例相应的升高。总凋亡率呈剂量依赖性，大于10μg/ml实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。3去甲斑蝥素作用24小时使RBE细胞阻滞在G2/M期，与对照组相比具有统计学意义（P=0.000, P=0.000, P=0.000,P＜0.01）。4瑞氏-姬姆萨染色与AO/EB染色细胞可见不同浓度去甲斑蝥素处理后细胞呈由轻到重不同程度的损伤和典型凋亡变化。5AO/EB染色荧光显微镜低倍镜下观测细胞凋亡结果显示：去甲斑蝥素作用于RBE细胞24小时后，随剂量升高橙色荧光细胞中呈簇出现并在视野中所占比例升高。40μg/ml剂量时，视野中橙色细胞占83.1%±15.6，明显高于阴性对照组（P＜0.01）。6Real-time PCR及Western blot结果显示，细胞色素c在胞浆中的浓度增加，bax、Actived-caspase-3在细胞中的含量渐增加，bcl-2mRNA表达降低。7α-Tubulin免疫组化染色观察到去甲斑蝥素干预后，微管蛋白α-Tubulin骨架结构被破坏，呈现无结构均一的环状。分裂中期的细胞无纺锤体出现。8Real-time PCR检测α-Tubulin mRNA表达水平均明显降低（P=0.002, P=0.000, P＜0.01），差异具有统计学差异。9扫描电镜观察去甲斑蝥素诱导胆管癌细胞超微结构变化。20μg/ml去甲斑蝥素使细胞突起变细断裂，表面微绒毛消失，表面卷曲、畸形。40μg/ml剂量时，细胞体积明显缩小，表面微绒毛和突起完全消失，膜结构出现凹陷，部分细胞形成有完整包膜小泡样结构突起于细胞表面。10透射电镜观察到20μg/ml去甲斑蝥素使细胞表面微绒毛消失，胞质减少，核膜向外呈锐角突起，亦可见部分包膜向外球形膨出，胞质中出现空泡。40μg/ml剂量时，细胞皱缩，表面微绒毛消失，细胞核中染色质浓缩，体积缩小，电子密度增加，边集于核边呈新月形，内质网扩张，脱颗粒，胞质出现空泡，线粒体嵴消失，包膜向外球形膨出，部分胞质填充其中。结论：1去甲斑蝥素可抑制人胆管癌RBE-TCHU179细胞增殖，诱导细胞凋亡，呈时间—剂量依赖关系。去甲斑蝥素作用后光镜和电镜均呈典型凋亡改变。2去甲斑蝥素通过增加bax、抑制bcl-2的转录和表达，释放细胞色素c激活Caspase-3诱导RBE细胞凋亡。3去甲斑蝥素通过破坏胆管癌RBE细胞tubulin骨架、抑制α-TubulinmRNA的表达，阻止纺锤体的形成，将细胞周期阻滞在G2/M期，导致生长抑制。