论文部分内容阅读
斯氏属(Steinernema)与异小杆属(Heterorhabditis)昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematode)是国际上新型的生物杀虫剂,它们分别与嗜线虫致病杆菌属Xenorhabdus(Thomas,1979)和发光杆菌属Photohabdus(Boemareet al,1993;Akhurst et al,1996)细菌互惠共生。嗜线虫致病杆菌属共生细菌Xenorhabdus能产生两种胞内晶体,其中IP-1编码的蛋白称为PixA,pixA的基因序列业已公布,但PixA晶体蛋白在线虫——细菌共生系统的生物学功能一直未能完全确定。本论文尝试原核表达pixA基因,并测定这一蛋白在可组合昆虫病原线虫的繁殖作用和非组合昆虫病原线虫的毒性作用。
本文以无菌斯氏线虫S.carpocapsae的共生细菌X.nematophila A24基因组DNA为模板,扩增到基因pixA,构建了pMD-18T-pixA克隆载体,测序结果与已收录序列完全一致。在此基础上,将目的基因与pET-32a(+)表达载体进行体外连接,构建了重组表达载体pET-32a(+)-pixA;于重组菌的对数生长期前期加入诱导剂IPTG(1 mmol/L),37℃2下诱导表达12 h,获得分子量为40.7 kDa的融合蛋自;融合蛋白以包涵体形式存在。免疫印记检测说明,大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-pixA大量表达重组融合蛋白。
为确定共生细菌产生的胞内晶体蛋白在线虫——细菌共生系统中的生物学功能,本论文利用斯氏线虫能够在大肠杆菌中生长繁殖的特性,建立了晶体蛋白表达菌株——线虫的液体培养系统。将重组表达菌株与目标线虫组合培养的结果显示,S.carpocapsae ALL和A24线虫第四天和第六天时在表达融合蛋白的菌体中大母虫或怀卵母虫占线虫总数的比例显著高于未表达重组蛋白的菌体组合。这说明利用大肠杆菌表达的PixA蛋白对斯氏属A24与ALL品系线虫的生长具有显著的促进作用。此外,表达的PixA蛋白在复性后测定其对非组合线虫Heterorhabiditis.bacteriophora H06感染期线虫死亡率的影响。结果显示,这一融合蛋白对H06线虫无毒性作用。
研究结果不仅有利于线虫——细菌共生系统共生机制的探索,而且将促进线虫的产业化发展。