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第一章视紫红质T17M突变体的亚细胞定位 目的:研究视紫红质T17M突变体的亚细胞定位及意义。 方法:构建pCDNA-3.1-T17M rhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc质粒，使用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法进行鉴定，基因测序。将构建成功的质粒转染到HEK293细胞，采用Western blot检测视紫红质T17M突变体和野生型的蛋白表达差异。免疫荧光显微镜下观察视紫红质T17M突变体和野生型的亚细胞定位。 结果:经过PCR扩增和双酶切鉴定，获得约1000bp大小的条带，基因测序显示第50位碱基C突变成T，成功构建pCDNA-3.1-T17Mrhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc质粒。质粒转染后，Western blot检测到约40KD的条带，转染可高效表达视紫红质T17M突变体和野生型蛋白。荧光显微镜检查发现，视紫红质T17突变体聚集在内质网，与高尔基体不存在共定位;而野生型主要位于细胞膜。 结论:视紫红质T17M突变体异常定位于内质网，与高尔基体不存在共定位。视紫红质野生型主要位于细胞膜。 第二章视紫红质T17M突变体的降解途径 目的:研究视紫红质T17M突变体的降解途径及意义。 方法:使用MTT法检测视紫红质T17M突变体和野生型的降解速度。Western blot检测溶酶体抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG132对视紫红质T17M突变体和野生型降解的影响。免疫沉淀检测视紫红质泛素化水平。Western blot检测p97/VCP-QQ和Erasin siRNA对视紫红质T17M突变体和野生型的半衰期的影响。 结果:蛋白合成抑制剂CHX处理HEK293细胞和ARPE-19细胞6h后，CHX处理前视紫红质蛋白标化为1，HEK293细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.219±0.032和0.635±0.072(P＜0.01)，ARPE-19细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.302±0.041和0.531±0.052(P＜0.01)。溶酶体抑制剂CQ处理HEK293细胞12h后，视紫红质T17M突变体由1增加到1.023±0.265，视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到1.433±0.159(P＜0.05)。蛋白酶体抑制剂MG132处理HEK293细胞6h后，视紫红质T17M突变体由1增加到7.213±2.108(P＜0.01)，视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到2.011±0.221(P＜0.05)。免疫沉淀后，泛素化视紫红质T17M突变体由1增加到2.200±0.361(P＜0.01)，野生型蛋白相对值由1增加到1.160±0.162。在ARPE-19细胞中过表达p97/VCP-QQ后，对照组和p97/VCP-QQ组的视紫红质T17M突变体蛋白相对值分别为0.159±0.052和0.558±0.095(P＜0.01)。Erasin siRNA处理后，视紫红质T17M突变体的对照组和Erasin siRNA组的蛋白相对值分别为0.230±0.059和0.602±0.064(P＜0.01)，而视紫红质野生型降解速度没有明显变化。 结论:与视紫红质野生型相比，T17M突变体降解加速。视紫红质T17M突变体只能通过蛋白酶体系统降解，而野生型可以通过自噬溶酶体系统和蛋白酶体系统降解。视紫红质T17M突变体的降解与泛素化的ERAD相关。过表达p97/VCP-QQ和Erasin siRNA干扰可以抑制视紫红质T17M突变体通过ERAD途径降解。 第三章视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制 目的:研究视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制。 方法:建立pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系，采用Western blot方法检测其蛋白酶体活性。过表达视紫红质蛋白，诱导内质网应激反应，采用Western blot方法检测内质网应激相关蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a的表达差异，并用PBA处理细胞，观察PBA对以上内质网应激相关蛋白表达的影响。Tunicamycin处理ARPE-19细胞，流式细胞仪检测细胞死亡数目。过表达视紫红质T17M突变体，采用流式细胞仪检测细胞内ROS水平，并使用ROS清除剂NAC和BHA处理，观察细胞死亡变化情况。 结果:pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系可稳定表达uGFP，视紫红质T17M突变、野生型的uGFP表达量没有显著变化。T17M突变可使细胞内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a表达上调，与视紫红质野生型相比，BIP、CHOP、GRP94、peIF-2a/eIF-2a、active ATF-6a表达量分别增加2.439±0.363倍(P＜0.01)、2.433±0.802倍(P＜0.01)、1.600±0.212倍(P＜0.05)、1.567±0.153(P＜0.05)、2.167±0.306倍(P＜0.01)。与视紫红质野生型相比，CHOP表达量在使用PBA处理前后分别增加了2.600±0.854倍和1.467±0.306倍(P＜0.05)，GRP94表达量处理前后增加1.921±0.557倍和1.203±0.239倍(P＜0.05)，peIF-2a/eIF-2a为1.733±0.154倍和1.167±0.252倍(P＜0.05)，active ATF-6a为2.564±0.406倍和1.349±0.529倍(P＜0.05)。而使用内质网应激诱导剂Tunicamycin前后，空载体、视紫红质野生型和T17M突变体的ARPE-19细胞死亡率分别为4.156％±0.501％和4.814％±0.531％、3.879％±0.413％和5.712％±0.574％、7.021％±0.612％和16.213％±3.419％，视紫红质T17M突变体过表达的细胞死亡率较空载体和野生型明显增加(P＜0.05)。与空载体组相比，视紫红质野生型和视紫红质T17M突变体ROS的相对比分别为1.136±0.055，1.935±0.088(P＜0.01)。使用ROS清除剂NAC和BHA后，空载体组、DMSO组、NAC组和BHA组的死亡率分别为3.716％±0.523％、7.322％±1.924％、4.857％±1.369％(相比DMSO组，P＜0.05)和4.271％±0.988％(相比DMSO组，P＜0.01)。 结论:视紫红质T17M突变不影响蛋白酶体活性。T17M突变能诱导细胞内质网应激，使内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a表达上调。化学分子伴侣PBA能缓解T17M诱导的内质网应激。视紫红质T17M突变增加细胞对内质网应激诱导剂Tunicamycin的敏感性。突变的T17M视紫红质增加细胞内ROS的水平，ROS清除剂NAC和BHA能抑制视紫红质T17M突变导致的细胞死亡。