论文部分内容阅读
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的传染性疾病，曾在全世界广泛流行。近年来由于抗结核药物的不当使用，导致了多药耐药菌株的出现，爱滋病(AIDS)的流行又增加了结核病的易感人群。这些原因使得结核病又在全世界范围内呈现上升趋势。因此，开发新的有效的抗结核药物已成为当务之急。
目的:即是找到编码内源性聚阿拉伯糖水解酶的基因。研究的技术路线是用多种不同的层析方法从M.smegmatismc2155菌株中纯化内源性聚阿拉伯糖水解酶，通过质谱(massspectrometry,MS)确定候选蛋白质的多肽序列，并根据多肽序列在数据库中查找候选蛋白质的基因编码序列，最后通过分子克隆技术表达候选酶蛋白以确认其功能并得到大量纯化酶蛋白以进行酶促动力学研究。
方法：1)建立稳定可信的酶活性测定方法。利用微量超滤装置(Microcon)实现反应底物与产物的有效分离来检测内源性聚阿拉伯糖水解酶的活性，并利用该方法检测EMB处理的M.smegmatismc2155菌株各细胞组分中内源性聚阿拉伯糖水解酶的活性水平。2)以M.smegmatismc2155菌株的可溶性细胞组分为原料，通过不同的柱层析方法(疏水作用层析，离子交换层析，chromatofocusing层析，sephacryl层析)逐步纯化内源性聚阿拉伯糖水解酶，在纯化过程中，用上述酶活性测定方法追踪酶活性。纯化后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。3)将电泳分离得到的候选蛋白进行胶上酶切，提取降解后的肽片段进行质谱分析。用软件将质谱信息转化为蛋白质的信息，再转化为基因的信息，通过在M.smegmatismc2155和M.tuberculosisH37Rv数据库中检索及同源性比较找出可能的内源性聚阿拉伯糖水解酶的候选基因。4)分别用不同的表达载体和宿主细胞(大肠杆菌，M.smegmatismc2155)表达这些候选蛋白并进行酶活性测定以确定内源性聚阿拉伯糖水解酶的编码基因。
结论：本研究建立的用于内源性聚阿拉伯糖水解酶活性测定的Microcon酶活性检测方法具有快速、稳定、准确及可定量的特点，适用于在酶纯化过程中追踪酶活性。通过对M.smegmatismc2155内源性聚阿拉伯糖水解酶的纯化，发现该酶为一种疏水性较强的蛋白质，等电点在7.0附近，在细胞中的含量极低。纯化后的样品经SDS-PAGE分离，相关蛋白经LC-MS或MALDI-TOF/MS鉴定，经比较分析确定M.smegmatismc2155内源性聚阿拉伯糖水解酶的编码基因可能是开放阅读框GMSORF5228或GMSORF6049之一。通过分子克隆技术在大肠杆菌菌株中表达候选基因GMSORF5228和GMSORF6049并获得可溶性表达产物。虽然经Microcon酶活性测定方法检测表达产物未表现出内源性聚阿拉伯糖水解酶活性，但由于单个亚基表达或表达系统缺乏必需的辅助因子等原因可能引起酶活性的丧失，因此，不能完全排除这些基因编码内源性聚阿拉伯糖水解酶的可能。具体原因有待进一步研究。