【研究背景及目的】在我国,肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）通常发生在肝硬化病人的晚期[1]。HCC由于其复杂多步骤的形成过程且常常伴有肝硬化,因此是一种高度异质性的肿瘤。所以,确定一个合适的生物靶点对于设计分子导向的肝癌治疗是至关重要的。科学家认为肝细胞肝癌通常起源于肝细胞并在富含各种间质细胞如巨噬细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞以及其他细胞组成的微环境中逐渐生长并进展成肝癌。在这些丰富的间质细胞中,肿瘤相关成纤维细胞（Cancer Associated Fibroblasts,CAFs）可以为肿瘤营造特殊的微环境促进肿瘤转移。来自临床和流行病学的证据都显示了CAF与许多癌症的预后有密切的关系,其中就包括了肝癌。尽管来源不同的CAFs显示出异质性,但其免疫学特征上都表达间质细胞的特征而不表达上皮的指标。在影响周围上皮细胞的生物学效应上,CAFs与癌旁成纤维细胞（peri-tumor fibroblasts,PTFs）有很大区别。在食管胃交界处腺癌和肝癌中,CAFs的α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达水平远高于正常的成纤维细胞。进一步研究发现,在肝癌标本中,癌灶中α-SMA阳性的细胞数多余癌旁中α-SMA阳性的细胞且CAFs的增殖能力强于PTFs。但是,肝癌细胞和CAFs/PTFs的旁分泌crosstalk机制仍然不太清楚。进一步的研究表明CAFs可以通过分泌许多种类的炎症因子,生长因子和趋化因子来促进肝癌的进展。例如,CAFs可以分泌如转化生长因子（Transforming growth factor,TGF-β）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）等可溶性细胞因子促进正常上皮细胞的恶性转化。CAFs分泌的HGF能过激活乳腺癌细胞c-MET通路而增加其侵袭能力。在这些CAFs所分泌的因子中,趋化因子作为炎症细胞的调节因子,能调控炎症细胞的生物学作用而最终影响肿瘤的微环境。在乳腺癌中,CAFs分泌的CXCL12可以招募循环系统中未成熟的内皮细胞而促进肿瘤血管的形成和肿瘤转移。CAFs还可以分泌CCL5激活HCC的PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路促进其上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。这些结果均表明趋化因子可以通过改变肿瘤微环境而促进肿瘤的进展。基于以上的研究背景,本研究主要探寻CAFs促HCC转移和侵袭的机制。我们主要从三方面进行研究。首先,由于HCC的转移侵袭能力的升高常常伴随EMT过程,所以我们试图通过Real-Time PCR、Westerning blotting和细胞免疫荧光等技术来证明HCC与CAFs共培养后可以发生上皮间质转化。第二部分,我们将CAFs与带有荧光素酶的HCC混合后对小鼠进行皮下成瘤,利用小动物荧光成像技术观察HCC在小鼠体内的转移情况来确定CAFs在动物体内是否能提高HCC的转移能力。第三部分研究CAFs促进HCC转移侵袭的机制,通过趋化因子蛋白芯片和ELISA筛选出CAFs和PTFs分泌差异较大的趋化因子后,研究这些趋化因子与肿瘤细胞通路的关系及CAFs与HCC的crosstalk中趋化因子作用和地位。为治疗分子靶向治疗肝癌提供新的策略。【研究方法】一、CAFs促进肝癌细胞的上皮-间质转化（一）收集CAFs和PTFs的条件培养基（Conditional Medium,CM）在35mm培养盘中培养CAFs和PTFs数量达到1×10⁵后,换成含3%胎牛血清的DMEM培养基,培养24小时后收集培液,用孔径为0.2μm的滤膜滤过后直接培养肝癌细胞,达到共培养的目的。（二）检测CAF对肝癌细胞EMT作用将HCC细胞株Huh7接种于细胞盘贴壁后,用无血清培养基培养12小时后换成CAFs/PTFs的CM后进行培养48小时。利用相差显微镜下直接观察,Real-Time PCR,Westerning blotting,细胞免疫荧光等技术观察和检测HCC的大体形态变化和EMT相关指标的变化。二、CAFs促进HCC在小鼠体内转移（一）慢病毒感染肝癌细胞株PLC建立能够表达荧光素酶的稳转细胞株将带有荧光素酶基因且具有抗嘌呤霉素特性的表达质粒和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞后收获病毒原液,直接将病毒原液感染PLC细胞24小时后,加入嘌呤霉素进行筛选3天后即可得到能够表达荧光素酶的PLC细胞。（二）皮下成瘤将PLC与CAFs或PTFs按5:1的数量（PLC细胞数量为2×10⁶,成纤维细胞数量为4×10⁵）比例混合后接种于NOD-SCID小鼠左前腋下,建立小鼠皮下种植瘤模型。种植八周后,当瘤体明显可见时,腹腔注射荧光素钾后处死小鼠。（三）动物成像将小鼠的心、肝、脑、肺、肾、脾和左前肢胫骨剥离后放入有溶解有荧光素钾的DMEM中在小动物成像系统中进行成像。统计每组小鼠的转移只数和转移器官数。（四）H&E染色验证肝癌转移灶将小鼠的肺甲醛固定和胫骨脱钙处理后,石蜡包埋切片,进行HE染色,观察肺内转移的癌结节和骨质破坏情况。三、CAFs分泌趋化因子促进HCC转移的机制（一）利用趋化因子蛋白芯片和ELISA筛选出CAFs与PTFs趋化因子表达谱中差异较大的趋化因子收集三株CAFs和PTFs无血清培养了24小时的CM,利用Raybiotech趋化因子芯片进行筛选。筛选出CAFs和PTFs分泌量差异较大的四种趋化因子CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16。收集13对CAFs/PTFs的CM和五株常见肝癌细胞的CM,利用CXCL16的ELISA试剂盒检测条件培养基中的CXCL16的绝对含量。（二）四种趋化因子对HCC的迁移和侵袭的影响趋化因子对HCC促迁移和侵袭的作用:趋化因子按浓度梯度配制成的DMEM后加入Transwell模型下室,上室接入5×10⁴个PLC或Huh7细胞,放入5%CO₂孵箱培养24小时后进行染色拍照和统计。趋化因子中和抗体抑制CAF促迁移或侵袭实验:在CAFs或PTFs的培液中加入趋化因子的中和抗体（1μg/ml）后加入到Transwell模型下室,上室接入5×10⁴个PLC细胞或Huh7细胞,放入孵箱培养24小时后进行染色拍照和统计。（三）利用趋化因子拮抗剂拮抗肝癌细胞的趋化因子受体后抑制CAF对HCC促迁移和侵袭作用用CCR2受体拮抗剂（INCB3284 100 n M）、CCR5受体拮抗剂（Maraviroc 100n M）和CCR1/3受体拮抗剂（UCB35625 100 n M）分别处理肝癌细胞后接入transwell上室,下室加入500μl 10%CAF的CM后放入CO₂培养箱中进行培养,24h后染色统计迁移率。（四）CAFs对Hedgehog和TGF-β通路激活作用Huh7细胞分别转染报告基因质粒（Wnt、Hippo、NF-KB、Hedgehog、TGF-β）后,更换为CAFs或PTFs的CM培养24h后检测荧光素酶表达情况,筛选出激活的通路。在饥饿处理的Huh7的培液中分别加入四种趋化因子刺激24小时,收集RNA,利用Real-Time PCR检测Hedgehog和TGF-β通路下游靶基因变化情况。在Transwell上室接入5×104个Huh7细胞后,分别加入Hedgehog和TGF-β通路抑制剂CYA（5u M）和SIS3（5u M）。下室加入分别加入含有四种趋化因子（20 mg/L）的DMEM,培养24小时后,染色拍照。（五）CXCL16,CCL7对于TGF-β通路重要蛋白的活化情况在培养的Huh7细胞中加入分别含有浓度为100 ng/ml的CXCL16和CCL7的无血清DMEM培养基。收集15分钟、30分钟、1小时和2小时的细胞蛋白,利用Westerning Blotting技术,检测TGF-β通路重要蛋白激活情况。（六）四种趋化因子对于肝癌细胞EMT作用在CAF的CM中加入四种趋化因子中和抗体混合抗体,培养Huh7细胞24小时后,收集蛋白和RNA,利用Real-Time PCR和Westerning Blotting技术检测EMT相关指标的变化情况。【结果】一、CAFs促进肝癌细胞EMT转化用CAFs的CM培养Huh7细胞后,Huh7在形态上由原来的扁平状逐渐变成梭形且伪足生成增多,说明Huh7的游动能力增加。细胞免疫荧光显示CAFs处理Huh7后间质指标Vimentin表达升高,上皮指标ZO-1表达下降。利用Real-Time PCR检测用CAFs的CM培养后的Huh7的m RNA后可发现间质指标如Vimentin、α-SMA、Twist1和N-cadherin表达上升,上皮指标如ZO-1和E-cadherin表达下降。Western blotting结果表明用CAFs处理后的Huh7的间质指标Vimentin和α-SMA表达上升。这些结果均说明CAFs促进Huh7发生EMT,恶性程度增加。二、CAFs促进肝癌细胞在体内转移将能够表达荧光素酶的肝癌细胞PLC和CAFs/PTFs混合后在NOD-SCID小鼠左侧腋窝下进行皮下成瘤。8周后腹腔注射荧光素钾后处死小鼠,将其心,肝,脾,肺,肾,左侧前肢胫骨和脑剥离后浸入含有荧光素钾的DMEM中进行活体成像,统计每组小鼠的转移器官数。并且将转移的器官进行H-E染色确定转移灶。结果显示与PTF组和单纯PLC组相比,CAFs组小鼠器官转移率最高,其中肺转移率为3/8,骨转移率为5/8,脑转移率为2/8,且H-E染色证实了骨转移灶和肺转移灶。体内实验说明CAFs具有提高HCC的转移能力。三、CAFs促进HCC转移的分子机制（一）CAFs和PTFs趋化因子表达不同趋化因子蛋白芯片显示趋化因子CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16在CAFs中分泌量明显高于PTFs。并且我们收集了十三对CAFs/PTFs的上清和5株HCC的培养上清,利用CXCL16的ELISA试剂盒检测了CXCL16的分泌量,结果显示十三对中7株CAFs的CXCL16分泌量高于其对应的PTFs。（二）检测CCL2,CCL5,CCL7和CXCL16对HCC迁移和侵袭的影响Transwell迁移/侵袭试验表明CCL2,CCL5,CCL7和CXCL16均可以促进HCC的迁移。但CCL7和CXCL16即可促进HCC迁移,也可促进其侵袭。（三）CAFs分泌的CCL2和CCL5可以激活肝癌细胞Hedgehog通路用CAFs/PTFs的CM培养HCC后,利用荧光色酶报告基因检测五条（Hedgehog,TGF-β、NF-KB、Wnt、Hippo通路）在信号转导激活情况,其中只有Hedgehog和TGF-β通路被显著激活。在Huh7中转染了Hedgehog的报告基因质粒后,单独加入CCL2和CCL5均可以激活报告基因的荧光素酶活性,在CAF的CM中分别加入CCL2和CCL5的中和抗体后,可以抑制CAF对Hedgehog通路的激活作用。利用Real-Time PCR结果显示,CCL2和CCL5均可以激活HCC中Hedgehog的下游靶基因。Hedgehog通路的抑制剂CYA可以抑制CCL2和CCL5对HCC促迁移作用。（四）CAF分泌的CCL7,CXCL16激活HCC的TGF-β通路在Huh7中转染了TGF-β的报告基因质粒后,加入CCL7和CXCL16均可以上调报告基因的荧光素酶活性,在CAF的CM中分别加入CCL7和CXCL16中和抗体后可以抑制CAF对TGF-β通路的激活作用。CCL7和CXCL16均可以激活HCC中TGF-β通路下游靶基因。TGF-β通路的抑制剂SIS3可以抑制CCL7和CXCL16对HCC促迁移和侵袭作用。利用Western Blotting发现CCL7,CXCL16可以增加HCC的smad2/3的磷酸化,说明CXCL16,CCL7可以激活TGF-β通路。（五）四种趋化因子的中和抗体可以阻断CAF促EMT过程在CAF的CM中加入四种趋化因子中和抗体后培养HCC,相比单纯用CAF的CM培养HCC,间质指标的升高有所下降,上皮指标的下降有所上升。说明这四种趋化因子中和抗体可以抑制CAF对HCC促EMT作用,从反面也说明这由CAF分泌的这四种趋化因子可以促进HCC的EMT。【结论】一、肿瘤相关成纤维细胞可以通过分泌趋化因子促进肝癌细胞上皮-间质转化。二、肿瘤相关成纤维细胞可以促进HCC在体内的转移。三、CAFs通肿瘤相关成纤维细胞过分泌CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16,分别激活肝癌细胞的Hedgehog和TGF-β通路而促进肝癌细胞上皮间质转化,增强其迁移和侵袭能力。