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目的:构建pMD18-T-CK20重组质粒标准品,利用Taqman探针技术,建立一种简便、快速、灵敏和特异的实时荧光定量检测尿CK20方法,用于膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder,TCCB)早期诊断、预后及复发监测。方法:1.培养膀胱癌T24细胞株,扩增CK20基因片段,并克隆入T-A载体构建pMD18-T-CK20重组质粒作为定量检测的标准品,用酶切、PCR、测序鉴定。2.设计针对CK20基因的引物和Taqman探针,建立实时荧光定量PCR(Real-time PCR or FQ-PCR)CK20检测方法,探讨最佳反应条件和反应体系,并进行方法学评价(包括线性范围、灵敏度、特异性、重复性)。3.将本法初步用于临床,检测60例TCCB患者、20例泌尿系非恶性肿瘤患者和15例健康志愿者尿CK20 mRNA表达,同时进行尿脱落细胞学HE染色检测。结果:1.标准品制备:成功构建重组质粒pMD18-T-CK20,经PCR、酶切和测序鉴定与预期结果一致,符合定量PCR标准品要求。2.定量PCR方法建立及评价:①实时荧光定量PCR两步法的最佳反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性30 sec,51℃退火70 sec;最适反应体系为:总体积25μl:10×PCR buffer: 2.5μl ,MgCl(225mmol/l): 3.5μl,dNTPs(2.5mmol/l): 2μl,Taq(5U/μl): 0.35μl,正义、反义引物(10pmol/μl)均为: 2.2μl , Taqman探针(10pmol/μl) : 2.2μl, cDNA: 2μl,灭菌蒸馏水: 8.05μl。②方法学评价:该法线性范围较宽(102～109 copies/μl),灵敏度高(102 copies/μl)、特异性好,重复性好(批内CV值为1.59%;天间CV值为2.34%)。3.初步临床应用:①该法检测60例TCCB患者,以CT值为30为诊断阈值,灵敏度为85%(51/60),高于尿脱落细胞学HE染色46.7%(28/60);特异性为94.3%(33/35),尿脱落细胞学特异性为100%,两方法检出率差异有统计学意义(P<0.01)。②TCCB组CK20表达(Mean 27712.95copies/ul)大于泌尿系非恶性肿瘤组(Mean 74.72 copies/ul)和健康志愿者组(Mean 8.61 copies/ul),差异均有统计学意义(p<0.01)。③TCCB组按G1、G2、G3分级CK20表达分别为(Mean 21680.5、30985.82、36333.89 copies/ul),G1和G2级差异有统计学意义(p=0.016);按Tis/Ta、T1-2、T3-4分期CK20表达分别为(Mean 20672.16、29213.19、35585.63 copies/ul),Tis/Ta和T1-2期差异有统计学意义(p=0.022)。结论:所建立实时荧光定量PCR方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化,适合临床实验室用于尿CK20 mRNA定量检测,有望用于临床TCCB早期诊断、预后及复发监测,并有助于鉴别疾病分期、分级。