【摘 要】
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目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒，为凋亡素VP3基因在治疗结肠癌方面的研究奠定基础。方法设计VP3cDNA扩增引物，从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序
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目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒，为凋亡素VP3基因在治疗结肠癌方面的研究奠定基础。方法设计VP3cDNA扩增引物，从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序列，与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接构建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒，PCR和EcoR Ⅴ酶切电泳鉴定；穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP经Pmel酶切线性化后，转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌，细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,质粒经PCR、PacI酶切电泳及测序鉴定，线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞，进行重组腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包装和扩增，采用CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达，观察其感染效率及表达水平。结果pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒构建鉴定成功。线性化的pShuttle-VP3-hrGFP转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌，重组质粒经酶切获得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段，PCR反应扩增出了402bp的片段，重组质粒测序证实VP3-hrGFP编码区成功地克隆入了腺病毒pAd中，且其序列与GeneBank中VP3CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的腺病毒，滴度为1.738×1012opu/ml，获得的重组腺病毒对SW480细胞的感染效率高于98%以上。结论用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒，并能在人结肠癌细胞中高效表达，为深入研究凋亡素VP3基因的抗肿瘤效应及探讨机制奠定了基础。
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