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微核试验是应用最广泛的体内遗传毒性检测方法,可用于多种靶器官的遗传毒性检测。其中肝微核试验方法是除造血系统微核试验以外研究较为深入的一种靶器官试验方法,因为与造血系统微核试验相比,肝微核试验可检测出代谢产物为一过性致癌物的前体致癌物。同时肝脏作为人体内最重要的代谢器官之一,多种遗传毒物都会导致肝脏的遗传毒性。因此在2014年第六届国际遗传毒理学的工作大会上,也有越来越多关于肝微核试验方法作为人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)S2(R1)第二种组合试验可在骨髓及外周血以外组织进行的体内试验的讨论,同时在工作大会上也提出了肝微核试验的推荐试验规程。但是肝微核试验在进入正式应用之前,需要经过大量验证。早在2004年,日本环境诱变剂/哺乳动物致突变性研究组内的微核试验方法的联合研究组已牵头开展了对幼年大鼠肝微核试验方法的国际联合验证,该方法的验证在2010年完成。对重复给药肝微核试验方法的联合验证则在2014年开始,已有大部分数据报道,为将来本试验指导原则的制定奠定了基础。与国外多家试验室已经完成肝微核试验的验证相比,国内对该项试验的研究才刚刚起步。本课题旨在首先建立大鼠重复给药肝微核试验方法,并验证该试验方法的可行性。同时ICH S2(R1)指导原则推荐将不同的遗传毒性终点的体内试验结合于同一实验中,并尝试与一般毒性试验联合,可大大提高试验效率,试验设计贴近3R原则,故本课题进一步尝试将肝微核试验方法与肝彗星试验、外周血微核试验及Pig-a基因突变试验联合进行体内遗传毒性检测,提高试验效率并尽量避免假阳性或假阴性的结果。本课题分为两部分:第一部分是以重复给药肝微核试验的国际联合验证的方法为基础,采用验证中的肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)进行大鼠重复给药肝微核试验方法的建立,初步验证该方法的灵敏度和重复性;同时将肝微核试验与肝彗星试验及外周血微核试验结合于同一实验中,联合表征DEN的遗传毒性信息,尝试建立体内遗传毒性多终点试验方法。第二部分主要应用不同机制的四种物质:金胺、邻氨基偶氮甲苯、1,3-丙烷磺内酯和氨基甲酸甲酯,并以DEN为阳性对照物对大鼠重复给药肝微核试验方法进行验证;在验证肝微核方法的同时,结合肝彗星试验、外周血微核试验或Pig-a基因突变试验联合检测各个受试物的遗传毒性,最大程度地表征受试物的遗传毒性信息,进一步验证体内遗传多终点试验的准确性及重复性。本研究所获得的结果主要如下:1、在大鼠重复给药肝微核试验方法的建立阶段,应用已知的遗传毒性阳性化合物DEN进行方法的建立。经过酶消化并固定后的肝细胞悬液,染色后在荧光显微镜下观察计数含微核的细胞数量,得到DEN的肝微核试验结果与国际联合验证中一致:DEN的中和高剂量组肝细胞中的微核率(%MNHEP)与阴性对照组相比有统计学意义的增加,且表现出剂量-反应关系;DEN的肝彗星试验结果也与文献中结果一致,与阴性对照组相比,DEN的低、中和高各剂量组平均DNA尾密度都出现了具有统计学意义的增加;在外周血微核试验中,DEN低、中及高剂量组中的网织红细胞微核率(%MN-RET)与阴性对照组相比均未出现统计学差异,与文献结果一致。因此本试验成功建立了大鼠重复给药肝微核试验方法,并证明了肝微核试验、肝彗星试验和外周血微核试验联合的体内多终点试验方法的可行性和重复性。2、在大鼠重复给药肝微核试验方法的验证阶段,金胺的肝微核试验和肝彗星结果均为阳性,外周血微核试验结果和Pig-a基因突变试验结果均呈阴性,这一物质的结果提示了与外周血微核相比肝微核试验的必要性;邻氨基偶氮甲苯的肝微核试验、肝彗星试验及Pig-a基因突变试验结果均为阴性,仅有外周血微核结果为阳性;1,3-丙烷磺内酯的肝微核试验、肝彗星试验和外周血微核试验结果均为阳性;氨基甲酸甲酯的肝微核试验、肝彗星试验与外周血微核试验的结果均为阴性,故氨基甲酸甲酯判定为非遗传毒性化合物。初步得到以下结论:1、DEN的肝微核试验结果为阳性,与国际联合验证中结果一致,因而本试验室初步建立了大鼠重复给药肝微核试验方法,同时将肝微核试验、肝彗星试验与外周血微核试验结合共同评价了DEN的遗传毒性,彗星试验与外周血微核试验的结果与文献报道一致,初步建立了体内遗传毒性多终点检测方法。2、采用四种不同机制的化合物对大鼠重复给药肝微核试验方法进行了方法学验证,肝微核试验结果大致符合预期,证明该方法有较高的灵敏度及重复性。3、同时进行的肝微核试验、肝彗星试验、外周血微核试验及Pig-a基因突变试验,除邻氨基偶氮甲苯的彗星试验结果与报道结果不符,可能是由于低剂量多次暴露的试验方法对彗星试验结果有所影响;对金胺和邻氨基偶氮甲苯两个物质进行了Pig-a基因突变试验,结果均呈阴性,与金胺和邻氨基偶氮甲苯的代谢活性产物在外周血暴露量都较少的事实相符;其他已知遗传毒性终点结果皆与已有报道一致,证明了体内遗传毒性多终点检测方法的准确性和重复性。综上所述,(1)本研究成功建立了大鼠重复给药肝微核试验方法;(2)选择了不同机制的四个化合物进一步验证了大鼠重复给药肝微核试验方法;(3)同时建立了体内多个终点遗传毒性检测方法,为今后肝微核试验与其他终点的体内遗传毒性试验或与一般毒理研究联合应用打下基础。