微藻污染微生物快速检测及防治技术研究

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工业产油微藻能通过光合作用将二氧化碳与光能大规模地转化为油脂,因此作为一种潜在可规模化的清洁能源生产和二氧化碳高值化方案,在国内外受到了广泛关注。污染微生物监测与防治是制约微藻实验室操作和工厂化养殖过程的核心瓶颈之一。传统的污染微生物检测鉴定方法主要依赖于形态学特征、生理生化反应以及基因型分析。这些方法需要长时间的微生物培养过程,滞后的病害诊断过程往往导致无法及时发现污染微生物,从而加重疫情,甚至带来灾难性影响。更有甚者,相当一部分污染微生物生长条件苛刻,在实验室条件下难以培养。面对这一现状,传统检验手段往往无能为力。因此,快速灵敏的污染微生物检测和精准防治在微藻养殖过程中具有重要的意义。本论文研究工作主要包括两大部分内容:第一部分是污染微生物的快速鉴定。由于微藻养殖过程中污染微生物种类的复杂性和认识的局限性,研究首先以具备相对明确基因型和病理表型的植物病原微生物为例,采用拉曼光谱技术实现了污染微生物的快速、原位、高效检测。该方法可应用于寄主范围广,多样化丰富的植物病原物,能快速特异地检测唐菖蒲伯克氏菌洋葱致病变种(Burkholderia gladioli pv.alliicola)和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi),同时能够区分不同种属、不同亚种、不同变种的植物病原。B.gladioli pv.alliicola和E.chrysanthemi在感染特征上极为相近,通过建立包括多个宿主范围广泛且感染特征一致的病原物参考拉曼光谱库,获取两种病原的显微拉曼光谱进行检测,能够分别准确鉴定出来。同时,利用PCA分析可以鉴别斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)和菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)两种来自同属不同种的病原物;也可以鉴别密执安棒杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和密执安棒杆菌狡诈亚种(Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus)两种来自同种不同亚种的病原物;还可以鉴别丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.pisi)和丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)两种来自同种不同致病变种的病原物;鉴别率均在80%以上。为了证明方法的有效性,在病原组织中原位检测唐菖蒲伯克氏菌洋葱致病变种和菊欧文氏菌,结果可以从单细胞水平原位检测植物组织感病部位的病原物,单独侵染和混合侵染识别率分别为15.6%、51.3%,53.4%;显微拉曼光谱检测结果与分子生物学检测方法相比,病原物检出率相当。该方法40分钟内可完成,无需微生物分离、无需细胞富集培养,在单细胞水平上实现对微生物的实时、原位、高效检测,在污染微生物快速发现方面具有明显的优势。第二部分是微藻养殖污染控制方法开发。为了进一步实现对污染微生物的精准防治,通过深度挖掘目标藻种与污染微生物遗传信息的差异,研究从已知靶点的“药物库”中,选取作用于特定代谢通路的“药物”,通过精准施药,从而实现了对污染微生物的防治。甾醇生物合成途径是商业杀菌剂的重要靶点,比较真菌和微藻的甲羟戊酸途径(MVA途径)和磷酸季戊四醇甲酯途径(MEP途径)锁定几种生物合成途径抑制剂;通过分析真菌和微藻的甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)基因序列,深入了解两者之间甾醇生物合成途径的关键酶和遗传结构的可能区别,进而选取几种甾醇生物合成酶化学抑制剂,美维洛林(MEV)、异恶草松(CLO)、特比萘芬(TBF)、两性霉素B(APT)、环菌唑(TTA)和戊唑醇(TBA)。通过测定发现,在浓度为2.5μg m L-1时MEV、CLO、TBF、APT和TBA仍然对海洋微拟球藻的相对生长速率、光系统II原初光能转化效率有较大影响;不同的化学抑制剂IC50浓度处理对海洋微拟球藻甾醇分布影响很大;只有TTA处理能促进海洋微拟球藻生长。不同浓度TTA处理酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和海洋硅藻海链藻(Thalassiosira sp.),其生长受到明显抑制,对甾醇生物合成酶化学抑制剂进一步筛选和表征;结果证明TTA是有效的,在低浓度剂量(1μg m L-1)仍能促进目标微藻的快速生长,同时抑制竞争藻株生长,建立了一种适合于海洋微拟球藻的特异性污染控制方法。研究表明,对甾醇生物合成途径交叉点的基因组比较有助于识别物种遗传结构差异,可为生产所需性状微藻提供适宜的、有针对性的污染微生物防治策略。本研究发现的基于物种特异的遗传特征,设计定制针对特定微藻藻种的微生物和杂藻污染防治的策略,为基于基因组信息的微藻精准药物的研发提供新的思路。
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