溪黄草药材HPLC指纹图谱鉴别与质量评价研究

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溪黄草原植物为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon lophanthoides (Buch.-Ham. ex D. Don) H. Hara和溪黄草R. serra (Maxim.) Hara的干燥地上部分。主产于长江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、广东、广西、福建等省区。性味苦、甘、寒,归肝、胆经,具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效。溪黄草作为清肝利胆药在广东大部分地区民间有着很长的使用历史。民间和历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药,治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎,为预防和治疗肝胆疾病的常用药。现作商品“溪黄草”入药的除线纹香茶菜外,还有同属植物狭基线纹香茶菜R. lophanthoides (Buch.-Ham ex D. Don) Hara var. gerardiana (Benth.) Hara、纤花香茶菜R. lophanthoides (Buch.-Ham ex D. Don) Hara var. graciliflora (Benth.)Hara和溪黄草R. serra (Maxim.) Hara。中药溪黄草来源复杂,同名异物、品种混乱普遍,且这类植物外形类似,开花前和干品都不易鉴别。广东部颁标准和国家药典2010版(附录)对溪黄草的基源收载以及学者间都存在争议。导致市场、临床上溪黄草的使用品种非常混乱,为保证和提高药材质量,促进中药标准化,在研究过程中要重视对溪黄草药材作基源鉴定。目的:1.建立溪黄草药材的HPLC特征指纹图谱,并对不同品种、不同产地溪黄草药材的指纹图谱进行鉴别研究,为科学评价、区别溪黄草品种与有效控制溪黄草药材质量提供可靠的方法。2.优选溪黄草中咖啡酸与迷迭香酸的超声提取工艺以及测定不同品种、不同产地溪黄草咖啡酸与迷迭香酸的含量。3.考察溪黄草不同采收期、加工方法和不同入药部位的有效活性成分的含量以及指纹图谱共有峰代表的化学成分累积量变化,为溪黄草的种植与采收提供科学依据。方法:1.分别考察了供试品溶液制备条件、色谱条件的筛选和方法学考察。其中色谱条件的筛选中分别对流动相的选择及梯度、检测波长、检测时间、不同液相色谱柱、不同酸及不同浓度、流速和柱温等因素进行考察。通过对37批次的溪黄草样品测定,以迷迭香酸为参照峰,确定共有峰,比较37批不同品种溪黄草的HPLC (?)旨纹图谱,并用中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统软件对其进行全面评价。2.以咖啡酸和迷迭香酸作为指标,采用正交设计,考察提取时间、溶媒倍量、乙醇浓度三个因素对提取的影响;采用HPLC法,以Dikma Diamonsil (2)(C18250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,以乙腈-0.3%磷酸为流动相梯度洗脱,流速为1.0mL/min;柱温为室温,检测波长为329nm。3.用HPLC指纹图谱技术及咖啡酸、迷迭香酸的含量变化,考察不同采收月份、入药部位和加工方法的狭基线纹香茶菜的质量。结果:1.建立了同时满足不同品种、产地溪黄草指纹图谱测定要求的色谱条件,所建立的各指纹图谱能够反映4个品种溪黄草的共性和特征性。线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜与纤花线纹香茶菜具有很高的相似性,相似度在0.60-0.99之间,且能检测出至少17个共有峰;而溪黄草与这两者间存在较大的差异性,相似度在0.2-0.45。聚类分析能将37批溪黄草分成两类,分别为线纹香茶菜及其变种和溪黄草。聚类分析与相似度方法结果一致。通过相似度、共有峰面积、特有峰比较及聚类分析,可将25批线纹香茶菜及变种再进一步归类分析,线纹香茶菜与狭基线纹香茶菜具有相同特有峰,纤花线纹香茶菜具有其特有峰。25批线纹香茶菜及变种按产区可分为4大类。2.优选出溪黄草中咖啡酸与迷迭香酸的最佳提取工艺条件为30%的乙醇,料液比(g:mL)1:30,超声提取40min;不同品种、不同产地溪黄草药材中咖啡酸、迷迭香酸的含量差异较大,其中纤花线纹香茶菜两者的平均含量均最高,其次为狭基线纹香茶菜,溪黄草的最低。3.不同采收期、不同加工方法中咖啡酸和迷迭香酸含量以及指纹图谱色谱峰有明显的变化。以咖啡酸和迷迭香酸活性成分含量考察狭基线纹香茶菜的最佳采收日期为7月和入冬前的11月,以7月份采收的药材质量最佳,指纹图谱技术考察结果与前者一致。不同加工方法对溪黄草化学成分及含量影响不同。阴干对溪黄草化学成分的破坏最小,晒干与阴干相近,烘干效果最差。结论:1.采取指纹图谱与双指标成分定量相结合的体系,同时体现了中药材中水溶性成分的整体特征和个体特征,得以更好的控制药材质量;建立了能鉴别不同溪黄草品种的指纹图谱鉴别方法,从指纹图谱(化学成分层面上)的区别解决了溪黄草的入药基源争议,建议溪黄草的基源应为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜及其变种,同属的溪黄草是另一种基源药材,另作一品种入药。2.超声提取工艺简单、经济、提取率高,可为中药溪黄草的开发利用、实验室研究提供参考。所建立的检测方法简单、准备、快捷,适合于溪黄草中酚酸成分的含量测定研究,为溪黄草的质量控制提供了依据。3.以7月份采收的药材质量最佳,每年采收两次,采收时间为7月和11月;药材加工方法采用自然晒干或阴干方法最佳。以叶多者质量为佳。为溪黄草的种植与采收提供科学依据。
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