论文部分内容阅读
本实验室刘智博士从长期施用甲基对硫磷的污染土壤中分离得到一株能以对硝基苯酚为唯一碳源生长的甲基对硫磷降解菌Pseudomonas putida DLL-E4。通过转座子标签法获得了10余株失去降解对硝基苯酚功能的插入突变株。其中有两株突变株，MT54和M18，除不能降解对硝基苯酚外还具有其它特性：MT54为温度敏感型突变株，在30℃时可以降解对硝基苯酚和对苯二酚，而在37℃时能降解对苯二酚但不能降解对硝基苯酚；M18则同时失去了对苯二酚和尿黑酸降解功能。根据Tn5已知序列设计引物，分别以突变株基因组DNA为模板向转座子上游（5’端）和下游（3’端）进行SEFA-PCR扩增，扩增产物经T-A克隆测序、拼接后在NCBI上进行BLAST比对。比对结果显示温敏突变株MT54失活的基因为一个功能未知基因，该基因附近存在一个热休克蛋白基因hscA，可能由于插入突变的极性效应，Tn5的插入导致了该热休克蛋白基因的失活，从而形成了MT54的这种温敏特性。突变株M18失活的基因与Pseudomonas putida KT2440尿黑酸1，2-双加氧酶基因（hmgA）同源性为92％。尿黑酸与对苯二酚在结构上相似，并且尿黑酸1，2-双加氧酶与对苯二酚1，2-双加氧酶作用位点也很相似。根据转座子侧翼序列测序结果设计引物从DLL-E4基因组DNA中扩增出hmgA基因，其表达产物HmgA具有很高的尿黑酸降解活性。将hmgA克隆至自杀性质粒pEX19Gm，转化至E．coli DH5aλpir中获得同源重组载体pEXhmgA，通过三亲接合的方式导入突变株M18中，实现了hmgA在M18染色体上的整合表达。整合了hmgA的Int18恢复了降解Phe的能力，但仍不能降解对硝基苯酚和对苯二酚。尿黑酸代谢途径与对硝基苯酚代谢途径的关联值得进一步深入研究。用clustalx分析软件将已报道的1，2，4-苯三酚（偏苯三酚）1，2-双加氧酶基因进行同源性比对，选择高保守区域并且根据假单胞菌密码子使用偏好设计兼并引物，以DLL-E4基因组DNA为模板成功扩增出约550bp的特异性条带，通过在GeneBank上进行核酸和蛋白质序列比对，发现该片段与Burkholderia ambifaria AMMD偏苯三酚1，2-双加氧酶（GeneBank accession No．EAO48077）同源性为67％，而与已报道的对苯二酚1，2-双加氧酶只有9％的同源性。将扩增得到的pnpC克隆至自杀性质粒pJQ200SK，转化至E．coli DH5aλpir中获得同源重组载体pJQ-pnpC，通过三亲接合转入DLL-E4中，通过同源重组单交换实现了pnpC基因的敲除。pnpC敲除后的DLL-dpnpC保留了甲基对硫磷水解酶活性，但失去了降解对苯二酚的功能，并且由于对苯二酚的反馈抑制使之只能部分降解对硝基苯酚，12h降解率约为5％，表明该片段编码了对硝基苯酚降解关键酶基因——1，2-双加氧酶基因。pnpC的获得为对硝基苯酚其它降解基因的克隆以及多功能基因工程菌的构建和对硝基苯酚污染的生物修复奠定了基础。