论文部分内容阅读
MicroRNAs是一类在动植物体内广泛表达的微小RNA分子,是调节基因表达的重要因子,通常在转录后水平发挥其调控作用。它能够通过识别并特异性结合其靶基因的3’-UTR来阻断翻译过程或者降解mRNA,从而实现调控作用。PPARs属于配体诱导核受体,在细胞内广泛参与许多代谢途径。PPAR-γ是其中的一员,是重要的细胞转录因子,又与脂质代谢有着密不可分的关系。PPAR-γ基因是奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯合成基因网络中的关键一环,其表达水平与细胞的甘油三酯合成量呈正相关,且甘油三酯是乳脂的主要成分。因此,PPAR-γ基因被我们选定为重点关注的靶基因。使用TargetScan预测可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNAs,共预测出69个可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNA。除去已证实存在靶向调控关系的miRNA,结合评分,我们选取了miR-454与miR-27b作为候选miRNAs。利用双荧光素酶报告检测miRNA和靶基因的互作关系。将牛的PPAR-γ基因的mRNA的全长3’UTR区克隆到双荧光素酶载体中的XhoI和NotI位点之间,产物长度为118bp。以TargetScan预测的miR-454和miR-27b的结合位点为依据构建突变型载体:突变I型载体(bos-PPARG–MUT1)突变为:AACGTGA,突变II型载体(bos-PPARG–MUT1)突变为:TGACACT。载体构建完成后,将其与miRNA mimics共转染入293T细胞。双荧光素酶活性报告显示,与对照组相比,miR-454的过表达使双荧光活性降低超过40%,显著低于对照组的荧光活性(p<0.05)。随着其预测靶位点的突变,miR-454的过表达使293T细胞中的荧光素酶活性显著增加且与对照组(NC)相比无明显变化(p>0.05);然而,与NC组相比,miR-27b的过表达使荧光活性下降不超过30%。结合以上实验结果可知,miR-454能直接结合PPAR-γ基因的3’UTR,表明miR-454可以调控PPAR-γ基因的表达,而miR-27b则无法通过预测位点靶向调控PPAR-γ基因的表达。为进一步探究miR-454对PPAR-γ基因的调控作用模式,将miR-454 mimics和miR-454 inhibitor转染到细胞中。荧光定量PCR结果显示,转染miR-454 mimics48h后,与对照组相比miR-454的表达量显著上升(p<0.05);而转染miR-454inhibitor后,与对照组相比miR-454的表达量显著下降(p<0.05)。结果表明成功过表达或干扰奶牛乳腺上皮细胞内的miR-454。对目的基因的荧光定量PCR结果显示,转染miR-454 mimics 48h后,与NC组相比PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著下降(p<0.05),而转染了miR-454 inhibitor后,与I-NC相比PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著上升(p<0.05)。结果表明通过对miR-454的过表达,PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著降低,而干扰miR-454的表达,使PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著上升。对Western Blot的显影图像结果进行灰度分析,结果显示:转染miR-454 mimics 48h后,与NC组相比转染miR-454 mimics使PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著下降(p<0.05),而与I-NC相比转染miR-454inhibitor使PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著上升(p<0.05)。结果表明通过对miR-454的过表达,PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著降低;而干扰miR-454的表达,PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著上升。该实验结果进一步确认了miR-454靶向作用于PPAR-γ基因,并有可能通过调控PPAR-γ基因的表达量影响甘油三酯合成。为了探究miR-454对甘油三酯合成的影响,将转染48 h后的奶牛乳腺上皮细胞进行油红O染色和细胞总甘油三酯测定。结果观察到过表达miR-454降低了脂滴的积累和甘油三酯的产生;而miR-454的抑制出现了相反的结果。因此,证实了miR-454可通过调控PPAR-γ基因的表达水平来影响乳脂合成。对PPAR-γ基因的下游基因的研究发现,转染miR-454 mimics 48 h后,与NC组相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平显著下降(p<0.05),而转染miR-454 inhibitor后,与I-NC相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平显著上升(p<0.05)。miR-454的过表达和干扰还能影响PPAR-γ基因下游的FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平,从而参与甘油三酯的合成途径。研究结果验证了miR-454是PPAR-γ基因的调控因子,miR-454能够通过调控PPAR-γ基因及下游基因的表达来影响甘油三酯的合成。本研究结果为优良品系奶牛选育提供了理论依据,也为乳脂代谢过程的研究提供了新的思路。