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培养高产、优质的肉牛一直是畜牧生产所追求的目标。传统的杂交育种方法存在效率低,周期长等问题。转基因技术可在较短时间内培育出具有优质性状的肉牛新品种,应用前景广泛。高效肌肉特异性启动子能够启动外源基因在骨骼肌细胞中的高效表达,对于提高肌肉产量的转基因肉牛生产具有重要意义。骨骼肌α-肌动蛋白(α-actin)所编码的蛋白质是骨骼肌中肌动蛋白的主要成分。本研究以牛α-actin基因启动子为对象,通过分子克隆技术对其启动子片段进行改造,期望筛选出活性较高且具有肌肉组织特异性的启动子,为今后肉质性状改良相关的牛转基因研究提供合适的肌肉特异性启动子。通过PCR定点突变启动子特定转录调控元件;在其上游和下游连接内含子;连接Myo G基因的启动子构建双启动子;增加正调控元件拷贝数等方法改造牛骨骼肌α-actin基因启动子;构建双荧光素酶报告基因质粒;瞬时转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,检测启动子的肌肉特异性和表达效率。最后选择经过改造后活性较高的启动子来验证其对牛骨骼肌α-actin基因表达的影响,具体研究内容及结果为:1.针对牛骨骼肌α-actin基因启动子,分析确定α-actin启动子中特定核苷酸序列的功能,应用PCR定点突变的方法,定点突变牛α-actin启动子缺失片段389bp中的Sp1/KLFs元件、430bp中的ZF5F元件和490bp中的Pax3元件;结果发现,Sp1/KLFs突变后启动子活性增强,为负调控元件;ZF5F和Pax3突变后启动子活性减弱,为牛α-actin启动子的正调控元件。2.根据Gen Bank上公布的序列,将牛骨骼肌α-actin基因的内含子I和内含子II,分别连在p GL3-α-actinp262的上游和下游,证明内含子I和内含子II插入启动子上游时均能提高启动子转录活性且具有肌肉特异性,而这两个内含子在启动子下游时并不提高启动子活性,证明内含子可以影响α-actin基因启动子活性,且具有位置效应。3.将Myo G基因启动子连接到牛α-actin基因启动子之前并构建了双启动子真核表达载体p GL3-Myo Gp373-α-actinp262。结果表明双启动子的转录活性较牛Myo G和α-actin基因启动子活性都显著提高,且保持较好的肌肉特异性。4.通过PCR扩增牛α-actin基因启动子中含有多个正调控元件的170bp序列,插入到启动子上游,构建含有两个和三个这一序列拷贝的重组质粒,并构建连接Myo G基因启动子部分调控元件的牛α-actin基因启动子,发现增加调控元件拷贝数后牛α-actin基因启动子活性明显提高,且具有肌肉特异性。5.根据Gen Bank上公布的序列,对牛α-actin基因从起始密码子至终止密码子进行克隆,将改造的含有多拷贝数调控元件的牛α-actin基因启动子连接至其上游,通过Real-time RCR,Western Blot,免疫荧光和微丝染色技术检测α-actin基因的表达量。发现改造的α-actin基因启动子可以显著地提高α-actin基因的表达量。