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第一部分：下丘脑GPC4的表达及与胰岛素抵抗的关系
目的：初步探索下丘脑GPC4的表达与肥胖及胰岛素抵抗的关系。方法：通过免疫组化方法检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白表达情况；再利用mRNA核酸原位杂交技术检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4的mRNA水平。同时随机分组6周龄的C57BL/6J小鼠分别进行普食和高脂喂养12周后采用WesternBlot技术检测下丘脑GPC4蛋白表达差异。
结果：下丘脑免疫组化结果显示GPC4蛋白在下丘脑中广泛表达，在ARC和VMH中高表达；mRNA核酸原位杂交同样发现GPC4的mRNA于ARC和PVN区域分布较多。相较于普食喂养，高脂喂养后的C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白水平显著降低(P＜0.01)。
结论：GPC4在下丘脑广泛表达，并且高表达于ARC和VMH区域；在高脂喂养的小鼠下丘脑中GPC4蛋白表达水平降低，这些结果提示GPC4可能参与下丘脑对摄食及能量代谢的调节。
第二部分：下丘脑GPC4对摄食及外周能量代谢的影响体内研究
第一节：下丘脑过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响及体内机制探索
目的：探索动物下丘脑过表达GPC4对摄食及外周能量代谢的影响。
方法：将同窝6周龄C57BL/6J小鼠随机分成4组，于第3脑室定位注射AAV-GFP和AAV-GPC4病毒，并给予ND或者HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标，并且在高脂喂养组中行BAT的HE染色观察BAT形态和免疫组化染色及WB检测UCP-1表达。各组进行下丘脑石蜡切片，免疫组化染色观察GPC4过表达后对下丘脑AgRP和POMC表达的影响。进一步将AAV-GFP和AAV-GPC4组随机分成2组，分别给予腹腔生理盐水或者胰岛素注射，观察不同组别下丘脑组织AgRP蛋白表达情况和AgRP神经c-fos表达情况，以及FoxO1出核情况。
结果：相较于对照组GFP组，下丘脑过表达GPC4后的普食组和高脂喂养组均表现出摄食增加，体重增加，糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积增加，氧耗减少。GPC4过表达后BAT的脂肪细胞体积增加，UCP-1表达减少。下丘脑组织中GPC4过表达后AgRP的蛋白水平表达均增加(IHC)，AgRP神经元中c-fos表达增加；ARC区域基线状
态及胰岛素刺激情况下FoxO1核内比例增加。
结论：下丘脑过表达GPC4可能通过IR/AKT/FoxO1信号通路抑制外周能量代谢，促进胰岛素抵抗。
第二节：AgRP神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的：采用在AgRP神经元中过表达GPC4的方式来验证GPC4是否可通过影响AgRP神经元活性和AgRP表达而影响小鼠摄食及外周能量代谢。
方法：将6周龄AgRP-cre小鼠随机分成4组，定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(GPC4过表达组)病毒，予以ND或者HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。小鼠造模后取BAT进行HE染色观察BAT形态和行免疫组化染色及WB检测产热相关蛋白UCP-1表达。4组小鼠下丘脑行免疫组化染色观察GPC4过表达后观察下丘脑AgRP表达变化。进一步将各组随机分成2组，分别予以腹腔生理盐水或者胰岛素注射，观察AgRP神经c-fos表达情况，并行免疫荧光共聚焦观察FoxO1出核情况。
结果：与对照组相比，在AgRP神经元特异性过表达GPC4后的普食和高脂喂养的小鼠均表现出摄食及体重增加，糖耐量和胰岛素耐
量曲线下面积增加，氧耗减少，能量代谢减少；BAT的脂肪细胞体积变大，UCP-1表达减少；并且AgRP蛋白表达增加，AgRP神经元中c-fos表达增加。FoxO1核内比例增加。
结论：GPC4过表达可通过AgRP神经元抑制外周能量代谢，促进胰岛素抵抗。
第三节：OBRb神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的：采用在OBRb神经元中过表达GPC4，探索GPC4是否通过影响leptin/JNK/STAT3信号通路影响摄食及外周能量代谢。
方法：将6周龄OBRb-cre小鼠随机分成2组，定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(过表达组)病毒，并给予HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。
结果：OBRb神经元特异性过表达GPC4高脂喂养后表现出摄食及体重增加的趋势，但无统计学差异。糖耐量曲线下葡萄糖及胰岛素面积增加，但无统计学差异。
结论：下丘脑过表达GPC4肯能不是主要通过影响leptin信号通路引起摄食及能量代谢变化。
第三部分GPC4调控摄食及能量代谢的机制
目的：探索GPC4调控摄食及外周能量代谢的机制。
方法：在SH-SY5Y细胞系中通过腺病毒转染过表达GPC4，观察在有无胰岛素抵抗模型中，行WB验证GPC4对胰岛素信号通路IR/AKT/FoxO1活性的影响。并检测在不同浓度和时间的胰岛素干预时GPC4对该信号通路活性的影响。在SD新生大鼠下丘脑神经元原代细胞中，用相似的方式验证GPC4对该信号通路的影响。最后在SH-SY5Y中验证GPC4和InsR的相互作用。GST-Pulldown探索是否有直接的相互作用。
结果：与对照组相比，在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗的SH-SY5Y细胞系模型中过表达GPC4后，均表现出胰岛素刺激后P-IR,P-AKT,P-FoxO1表达降低，并且，胰岛素刺激后FoxO1出核比例减少。随着胰岛素浓度增加，GPC4过表达后均抑制了P-IR,P-AKT,P-FoxO1的表达，FoxO1核内比例增加。延长胰岛素处理后检测时间，发现GPC4处理后随着时间的延长P-IR,P-AKT,P-FoxO1下降更快，并且FoxO1出核减缓。Co-IP结果证实GPC4和InsR之间有相互作用，并且胰岛素浓度增加不会影响GPC4和InsR之间的相互作用。进一步检测发现GPC4过表达后抑制了IR和P85的相互作用。但大肠杆菌过表达的重组蛋白在GST-Pulldown结果中未能确认GPC4和InsR之间的直接相互作用。
结论：GPC4可与InsR相互作用抑制InsR/AKT/FoxO1信号通路影响小鼠的摄食和全身能量代谢。
目的：初步探索下丘脑GPC4的表达与肥胖及胰岛素抵抗的关系。方法：通过免疫组化方法检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白表达情况；再利用mRNA核酸原位杂交技术检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4的mRNA水平。同时随机分组6周龄的C57BL/6J小鼠分别进行普食和高脂喂养12周后采用WesternBlot技术检测下丘脑GPC4蛋白表达差异。
结果：下丘脑免疫组化结果显示GPC4蛋白在下丘脑中广泛表达，在ARC和VMH中高表达；mRNA核酸原位杂交同样发现GPC4的mRNA于ARC和PVN区域分布较多。相较于普食喂养，高脂喂养后的C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白水平显著降低(P＜0.01)。
结论：GPC4在下丘脑广泛表达，并且高表达于ARC和VMH区域；在高脂喂养的小鼠下丘脑中GPC4蛋白表达水平降低，这些结果提示GPC4可能参与下丘脑对摄食及能量代谢的调节。
第二部分：下丘脑GPC4对摄食及外周能量代谢的影响体内研究
第一节：下丘脑过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响及体内机制探索
目的：探索动物下丘脑过表达GPC4对摄食及外周能量代谢的影响。
方法：将同窝6周龄C57BL/6J小鼠随机分成4组，于第3脑室定位注射AAV-GFP和AAV-GPC4病毒，并给予ND或者HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标，并且在高脂喂养组中行BAT的HE染色观察BAT形态和免疫组化染色及WB检测UCP-1表达。各组进行下丘脑石蜡切片，免疫组化染色观察GPC4过表达后对下丘脑AgRP和POMC表达的影响。进一步将AAV-GFP和AAV-GPC4组随机分成2组，分别给予腹腔生理盐水或者胰岛素注射，观察不同组别下丘脑组织AgRP蛋白表达情况和AgRP神经c-fos表达情况，以及FoxO1出核情况。
结果：相较于对照组GFP组，下丘脑过表达GPC4后的普食组和高脂喂养组均表现出摄食增加，体重增加，糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积增加，氧耗减少。GPC4过表达后BAT的脂肪细胞体积增加，UCP-1表达减少。下丘脑组织中GPC4过表达后AgRP的蛋白水平表达均增加(IHC)，AgRP神经元中c-fos表达增加；ARC区域基线状
态及胰岛素刺激情况下FoxO1核内比例增加。
结论：下丘脑过表达GPC4可能通过IR/AKT/FoxO1信号通路抑制外周能量代谢，促进胰岛素抵抗。
第二节：AgRP神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的：采用在AgRP神经元中过表达GPC4的方式来验证GPC4是否可通过影响AgRP神经元活性和AgRP表达而影响小鼠摄食及外周能量代谢。
方法：将6周龄AgRP-cre小鼠随机分成4组，定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(GPC4过表达组)病毒，予以ND或者HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。小鼠造模后取BAT进行HE染色观察BAT形态和行免疫组化染色及WB检测产热相关蛋白UCP-1表达。4组小鼠下丘脑行免疫组化染色观察GPC4过表达后观察下丘脑AgRP表达变化。进一步将各组随机分成2组，分别予以腹腔生理盐水或者胰岛素注射，观察AgRP神经c-fos表达情况，并行免疫荧光共聚焦观察FoxO1出核情况。
结果：与对照组相比，在AgRP神经元特异性过表达GPC4后的普食和高脂喂养的小鼠均表现出摄食及体重增加，糖耐量和胰岛素耐
量曲线下面积增加，氧耗减少，能量代谢减少；BAT的脂肪细胞体积变大，UCP-1表达减少；并且AgRP蛋白表达增加，AgRP神经元中c-fos表达增加。FoxO1核内比例增加。
结论：GPC4过表达可通过AgRP神经元抑制外周能量代谢，促进胰岛素抵抗。
第三节：OBRb神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的：采用在OBRb神经元中过表达GPC4，探索GPC4是否通过影响leptin/JNK/STAT3信号通路影响摄食及外周能量代谢。
方法：将6周龄OBRb-cre小鼠随机分成2组，定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(过表达组)病毒，并给予HFD喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。
结果：OBRb神经元特异性过表达GPC4高脂喂养后表现出摄食及体重增加的趋势，但无统计学差异。糖耐量曲线下葡萄糖及胰岛素面积增加，但无统计学差异。
结论：下丘脑过表达GPC4肯能不是主要通过影响leptin信号通路引起摄食及能量代谢变化。
第三部分GPC4调控摄食及能量代谢的机制
目的：探索GPC4调控摄食及外周能量代谢的机制。
方法：在SH-SY5Y细胞系中通过腺病毒转染过表达GPC4，观察在有无胰岛素抵抗模型中，行WB验证GPC4对胰岛素信号通路IR/AKT/FoxO1活性的影响。并检测在不同浓度和时间的胰岛素干预时GPC4对该信号通路活性的影响。在SD新生大鼠下丘脑神经元原代细胞中，用相似的方式验证GPC4对该信号通路的影响。最后在SH-SY5Y中验证GPC4和InsR的相互作用。GST-Pulldown探索是否有直接的相互作用。
结果：与对照组相比，在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗的SH-SY5Y细胞系模型中过表达GPC4后，均表现出胰岛素刺激后P-IR,P-AKT,P-FoxO1表达降低，并且，胰岛素刺激后FoxO1出核比例减少。随着胰岛素浓度增加，GPC4过表达后均抑制了P-IR,P-AKT,P-FoxO1的表达，FoxO1核内比例增加。延长胰岛素处理后检测时间，发现GPC4处理后随着时间的延长P-IR,P-AKT,P-FoxO1下降更快，并且FoxO1出核减缓。Co-IP结果证实GPC4和InsR之间有相互作用，并且胰岛素浓度增加不会影响GPC4和InsR之间的相互作用。进一步检测发现GPC4过表达后抑制了IR和P85的相互作用。但大肠杆菌过表达的重组蛋白在GST-Pulldown结果中未能确认GPC4和InsR之间的直接相互作用。
结论：GPC4可与InsR相互作用抑制InsR/AKT/FoxO1信号通路影响小鼠的摄食和全身能量代谢。