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第一部分:下丘脑GPC4的表达及与胰岛素抵抗的关系
目的:初步探索下丘脑GPC4的表达与肥胖及胰岛素抵抗的关系。方法:通过免疫组化方法检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白表达情况;再利用mRNA核酸原位杂交技术检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4的mRNA水平。同时随机分组6周龄的C57BL/6J小鼠分别进行普食和高脂喂养12周后采用WesternBlot技术检测下丘脑GPC4蛋白表达差异。
结果:下丘脑免疫组化结果显示GPC4蛋白在下丘脑中广泛表达,在ARC和VMH中高表达;mRNA核酸原位杂交同样发现GPC4的mRNA于ARC和PVN区域分布较多。相较于普食喂养,高脂喂养后的C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白水平显著降低(P<0.01)。
结论:GPC4在下丘脑广泛表达,并且高表达于ARC和VMH区域;在高脂喂养的小鼠下丘脑中GPC4蛋白表达水平降低,这些结果提示GPC4可能参与下丘脑对摄食及能量代谢的调节。
第二部分:下丘脑GPC4对摄食及外周能量代谢的影响体内研究
第一节:下丘脑过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响及体内机制探索
目的:探索动物下丘脑过表达GPC4对摄食及外周能量代谢的影响。
方法:将同窝6周龄C57BL/6J小鼠随机分成4组,于第3脑室定位注射AAV-GFP和AAV-GPC4病毒,并给予ND或者HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标,并且在高脂喂养组中行BAT的HE染色观察BAT形态和免疫组化染色及WB检测UCP-1表达。各组进行下丘脑石蜡切片,免疫组化染色观察GPC4过表达后对下丘脑AgRP和POMC表达的影响。进一步将AAV-GFP和AAV-GPC4组随机分成2组,分别给予腹腔生理盐水或者胰岛素注射,观察不同组别下丘脑组织AgRP蛋白表达情况和AgRP神经c-fos表达情况,以及FoxO1出核情况。
结果:相较于对照组GFP组,下丘脑过表达GPC4后的普食组和高脂喂养组均表现出摄食增加,体重增加,糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积增加,氧耗减少。GPC4过表达后BAT的脂肪细胞体积增加,UCP-1表达减少。下丘脑组织中GPC4过表达后AgRP的蛋白水平表达均增加(IHC),AgRP神经元中c-fos表达增加;ARC区域基线状
态及胰岛素刺激情况下FoxO1核内比例增加。
结论:下丘脑过表达GPC4可能通过IR/AKT/FoxO1信号通路抑制外周能量代谢,促进胰岛素抵抗。
第二节:AgRP神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的:采用在AgRP神经元中过表达GPC4的方式来验证GPC4是否可通过影响AgRP神经元活性和AgRP表达而影响小鼠摄食及外周能量代谢。
方法:将6周龄AgRP-cre小鼠随机分成4组,定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(GPC4过表达组)病毒,予以ND或者HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。小鼠造模后取BAT进行HE染色观察BAT形态和行免疫组化染色及WB检测产热相关蛋白UCP-1表达。4组小鼠下丘脑行免疫组化染色观察GPC4过表达后观察下丘脑AgRP表达变化。进一步将各组随机分成2组,分别予以腹腔生理盐水或者胰岛素注射,观察AgRP神经c-fos表达情况,并行免疫荧光共聚焦观察FoxO1出核情况。
结果:与对照组相比,在AgRP神经元特异性过表达GPC4后的普食和高脂喂养的小鼠均表现出摄食及体重增加,糖耐量和胰岛素耐
量曲线下面积增加,氧耗减少,能量代谢减少;BAT的脂肪细胞体积变大,UCP-1表达减少;并且AgRP蛋白表达增加,AgRP神经元中c-fos表达增加。FoxO1核内比例增加。
结论:GPC4过表达可通过AgRP神经元抑制外周能量代谢,促进胰岛素抵抗。
第三节:OBRb神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的:采用在OBRb神经元中过表达GPC4,探索GPC4是否通过影响leptin/JNK/STAT3信号通路影响摄食及外周能量代谢。
方法:将6周龄OBRb-cre小鼠随机分成2组,定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(过表达组)病毒,并给予HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。
结果:OBRb神经元特异性过表达GPC4高脂喂养后表现出摄食及体重增加的趋势,但无统计学差异。糖耐量曲线下葡萄糖及胰岛素面积增加,但无统计学差异。
结论:下丘脑过表达GPC4肯能不是主要通过影响leptin信号通路引起摄食及能量代谢变化。
第三部分GPC4调控摄食及能量代谢的机制
目的:探索GPC4调控摄食及外周能量代谢的机制。
方法:在SH-SY5Y细胞系中通过腺病毒转染过表达GPC4,观察在有无胰岛素抵抗模型中,行WB验证GPC4对胰岛素信号通路IR/AKT/FoxO1活性的影响。并检测在不同浓度和时间的胰岛素干预时GPC4对该信号通路活性的影响。在SD新生大鼠下丘脑神经元原代细胞中,用相似的方式验证GPC4对该信号通路的影响。最后在SH-SY5Y中验证GPC4和InsR的相互作用。GST-Pulldown探索是否有直接的相互作用。
结果:与对照组相比,在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗的SH-SY5Y细胞系模型中过表达GPC4后,均表现出胰岛素刺激后P-IR,P-AKT,P-FoxO1表达降低,并且,胰岛素刺激后FoxO1出核比例减少。随着胰岛素浓度增加,GPC4过表达后均抑制了P-IR,P-AKT,P-FoxO1的表达,FoxO1核内比例增加。延长胰岛素处理后检测时间,发现GPC4处理后随着时间的延长P-IR,P-AKT,P-FoxO1下降更快,并且FoxO1出核减缓。Co-IP结果证实GPC4和InsR之间有相互作用,并且胰岛素浓度增加不会影响GPC4和InsR之间的相互作用。进一步检测发现GPC4过表达后抑制了IR和P85的相互作用。但大肠杆菌过表达的重组蛋白在GST-Pulldown结果中未能确认GPC4和InsR之间的直接相互作用。
结论:GPC4可与InsR相互作用抑制InsR/AKT/FoxO1信号通路影响小鼠的摄食和全身能量代谢。
目的:初步探索下丘脑GPC4的表达与肥胖及胰岛素抵抗的关系。方法:通过免疫组化方法检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白表达情况;再利用mRNA核酸原位杂交技术检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4的mRNA水平。同时随机分组6周龄的C57BL/6J小鼠分别进行普食和高脂喂养12周后采用WesternBlot技术检测下丘脑GPC4蛋白表达差异。
结果:下丘脑免疫组化结果显示GPC4蛋白在下丘脑中广泛表达,在ARC和VMH中高表达;mRNA核酸原位杂交同样发现GPC4的mRNA于ARC和PVN区域分布较多。相较于普食喂养,高脂喂养后的C57BL/6J小鼠下丘脑GPC4蛋白水平显著降低(P<0.01)。
结论:GPC4在下丘脑广泛表达,并且高表达于ARC和VMH区域;在高脂喂养的小鼠下丘脑中GPC4蛋白表达水平降低,这些结果提示GPC4可能参与下丘脑对摄食及能量代谢的调节。
第二部分:下丘脑GPC4对摄食及外周能量代谢的影响体内研究
第一节:下丘脑过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响及体内机制探索
目的:探索动物下丘脑过表达GPC4对摄食及外周能量代谢的影响。
方法:将同窝6周龄C57BL/6J小鼠随机分成4组,于第3脑室定位注射AAV-GFP和AAV-GPC4病毒,并给予ND或者HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标,并且在高脂喂养组中行BAT的HE染色观察BAT形态和免疫组化染色及WB检测UCP-1表达。各组进行下丘脑石蜡切片,免疫组化染色观察GPC4过表达后对下丘脑AgRP和POMC表达的影响。进一步将AAV-GFP和AAV-GPC4组随机分成2组,分别给予腹腔生理盐水或者胰岛素注射,观察不同组别下丘脑组织AgRP蛋白表达情况和AgRP神经c-fos表达情况,以及FoxO1出核情况。
结果:相较于对照组GFP组,下丘脑过表达GPC4后的普食组和高脂喂养组均表现出摄食增加,体重增加,糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积增加,氧耗减少。GPC4过表达后BAT的脂肪细胞体积增加,UCP-1表达减少。下丘脑组织中GPC4过表达后AgRP的蛋白水平表达均增加(IHC),AgRP神经元中c-fos表达增加;ARC区域基线状
态及胰岛素刺激情况下FoxO1核内比例增加。
结论:下丘脑过表达GPC4可能通过IR/AKT/FoxO1信号通路抑制外周能量代谢,促进胰岛素抵抗。
第二节:AgRP神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的:采用在AgRP神经元中过表达GPC4的方式来验证GPC4是否可通过影响AgRP神经元活性和AgRP表达而影响小鼠摄食及外周能量代谢。
方法:将6周龄AgRP-cre小鼠随机分成4组,定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(GPC4过表达组)病毒,予以ND或者HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。小鼠造模后取BAT进行HE染色观察BAT形态和行免疫组化染色及WB检测产热相关蛋白UCP-1表达。4组小鼠下丘脑行免疫组化染色观察GPC4过表达后观察下丘脑AgRP表达变化。进一步将各组随机分成2组,分别予以腹腔生理盐水或者胰岛素注射,观察AgRP神经c-fos表达情况,并行免疫荧光共聚焦观察FoxO1出核情况。
结果:与对照组相比,在AgRP神经元特异性过表达GPC4后的普食和高脂喂养的小鼠均表现出摄食及体重增加,糖耐量和胰岛素耐
量曲线下面积增加,氧耗减少,能量代谢减少;BAT的脂肪细胞体积变大,UCP-1表达减少;并且AgRP蛋白表达增加,AgRP神经元中c-fos表达增加。FoxO1核内比例增加。
结论:GPC4过表达可通过AgRP神经元抑制外周能量代谢,促进胰岛素抵抗。
第三节:OBRb神经元过表达GPC4对摄食及能量代谢的影响
目的:采用在OBRb神经元中过表达GPC4,探索GPC4是否通过影响leptin/JNK/STAT3信号通路影响摄食及外周能量代谢。
方法:将6周龄OBRb-cre小鼠随机分成2组,定位ARC注射AAV-DIO-GFP(对照组)和AAV-DIO-GPC4(过表达组)病毒,并给予HFD喂养12周,测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸商等代谢指标。
结果:OBRb神经元特异性过表达GPC4高脂喂养后表现出摄食及体重增加的趋势,但无统计学差异。糖耐量曲线下葡萄糖及胰岛素面积增加,但无统计学差异。
结论:下丘脑过表达GPC4肯能不是主要通过影响leptin信号通路引起摄食及能量代谢变化。
第三部分GPC4调控摄食及能量代谢的机制
目的:探索GPC4调控摄食及外周能量代谢的机制。
方法:在SH-SY5Y细胞系中通过腺病毒转染过表达GPC4,观察在有无胰岛素抵抗模型中,行WB验证GPC4对胰岛素信号通路IR/AKT/FoxO1活性的影响。并检测在不同浓度和时间的胰岛素干预时GPC4对该信号通路活性的影响。在SD新生大鼠下丘脑神经元原代细胞中,用相似的方式验证GPC4对该信号通路的影响。最后在SH-SY5Y中验证GPC4和InsR的相互作用。GST-Pulldown探索是否有直接的相互作用。
结果:与对照组相比,在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗的SH-SY5Y细胞系模型中过表达GPC4后,均表现出胰岛素刺激后P-IR,P-AKT,P-FoxO1表达降低,并且,胰岛素刺激后FoxO1出核比例减少。随着胰岛素浓度增加,GPC4过表达后均抑制了P-IR,P-AKT,P-FoxO1的表达,FoxO1核内比例增加。延长胰岛素处理后检测时间,发现GPC4处理后随着时间的延长P-IR,P-AKT,P-FoxO1下降更快,并且FoxO1出核减缓。Co-IP结果证实GPC4和InsR之间有相互作用,并且胰岛素浓度增加不会影响GPC4和InsR之间的相互作用。进一步检测发现GPC4过表达后抑制了IR和P85的相互作用。但大肠杆菌过表达的重组蛋白在GST-Pulldown结果中未能确认GPC4和InsR之间的直接相互作用。
结论:GPC4可与InsR相互作用抑制InsR/AKT/FoxO1信号通路影响小鼠的摄食和全身能量代谢。