目的:研究在体及离体情况下肝素钠(UFH)对血小板聚集的影响,探讨阿司匹林对UFH相关ADP诱导的血小板聚集可能的增强作用并初步探讨其机制。方法:纯种新西兰家兔16只,静脉注射肝素钠200IU/kg前(0min)及注射后20min采血,检测并比较全血二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、诱导的血小板聚集。后随机分为两组:阿司匹林组和氯吡咯雷组。阿司匹林组首先给予阿司匹林(巴米尔12mg/Kg.d)灌胃,连用7天(第1~7天);而后加用氯吡格雷(4mg/Kg.d)双药联合灌胃7天(第8~14天),分别于第7天和第14天静脉注射肝素钠200IU/kg,注射前(0 min)及注射后20min采血,检测并比较全血ADP、AA诱导的血小板聚集。氯吡格雷组首先予以氯吡格雷(4mg/Kg.d)灌胃,连用7天(第1~7天);而后加用阿司匹林(巴米尔12mg/Kg.d)双药联合灌胃7天(第8~14天),分别在第7天和第14天静脉注射肝素钠(用量同前),注射前(0 min)及注射后20 min采血,检测并比较全血ADP、AA诱导的血小板聚集。纯种新西兰家兔12只,静脉注射达肝素钠200IU/kg前(0min)及注射后20min采血,检测并比较全血ADP、AA诱导的血小板聚集。后随机分为阿司匹林组和氯吡咯雷组两组。阿司匹林组首先给予阿司匹林(巴米尔12mg/Kg.d)灌胃,连用7天(第1~7天);而后加用氯吡格雷(4mg/Kg.d)双药联合灌胃7天(第8~14天)。分别于第7天和第14天静脉注射达肝素钠200IU/kg,注射前(0 min)及注射后20 min采血,检测并比较全血血小板聚集。氯吡格雷组首先予以氯吡格雷(4mg/Kg.d)灌胃,连用7天(第1~7天);而后加用阿司匹林(巴米尔12mg/Kg.d)双药联合灌胃7天(第8~14天)。分别在第7天和第14天静脉注射达肝素钠(用量同前),注射前(0 min)及注射后20 min采血,检测并比较全血ADP、AA诱导的血小板聚集。在前期动物实验的基础上,分析比较了不同浓度的肝素钠对人体外血小板聚集作用。取新鲜机采健康成人血小板悬液24人份,每份5毫升,每份标本平均分为五组,每组1毫升,分别加入终浓度为1IU/mL~4IU/mL的肝素钠及空白对照管(血小板原液)共同置于恒温水浴槽,37℃恒温孵育10分钟分别检测ADP(终浓度为10umol/L)诱导的血小板聚集。新鲜机采健康成人血小板悬液36人份,每份5毫升,分组及药物干预同上,37℃恒温孵育20分钟分别检测ADP(终浓度同前)诱导的血小板聚集。基于前面的实验研究,我们进一步探讨了肝素钠增强ADP诱导的血小板聚集机制,同时应用阿司匹林与人血小板体外共孵育,进一步探讨阿司匹林对于人肝素钠相关ADP诱导的血小板聚集的可能的增强作用及其可能的机制。取新鲜机采人血小板悬液56人份,每份5毫升,每份标本平均分为五组:①血小板原液预孵育5分钟后加入肝素4IU/mL;②阿司匹林(终浓度为100umol/L)37℃预孵育5分钟后加入肝素4IU/mL;③阿司匹林和A2P5P(终浓度为300umol/L)37℃预孵育5分钟后加入肝素4IU/mL;④A2P5P(终浓度同前)37℃预孵育5分钟后加入肝素4IU/mL;⑤生理盐水等量预孵育5分钟,37℃恒温孵育10分钟及20分钟,分别检测各组ADP诱导的血小板聚集。VASP是血小板内蛋白,其磷酸化依赖于P2Y12受体的活性。应用流式细胞术方法可定量检测VASP磷酸化(VASP-P)水平并计算血小板反应指数(platelet reactivity index, PRI)。基于前面实验药物孵育20分钟作用最强,故在此试验中,选取20分钟作为孵育时间。健康人人机采血小板悬液40人份,每份4毫升,每人份血小板平均分为四组,每组1毫升,分别给予:①血小板原液37℃恒温孵育5分钟再加入肝素钠(终浓度为4IU/mL)37℃恒温孵育20分钟②首先加入ASA(终浓度为100umol/L)37℃恒温孵育5分钟,再加入肝素钠(浓度同前)恒温孵育20分钟;③首先加入A2P5P(终浓度为300umol/L)和ASA(浓度同前)37℃恒温孵育5分钟,再加入肝素钠(浓度同前)恒温孵育20分钟;④加入生理盐水等量37℃恒温孵育25分钟。预处理后的血小板分别检测VASP磷酸化水平。根据静息态(+PGE1)和激活态(PGE1+ADP)时矫正的平均荧光强度(cMFI)计算血小板反应性指数(PRI)。PRI=[(MFIPGE1-MFIPGE1+ADP)/ MFIPGE1]×100另外,我们在透射电镜下观察了人血小板在不同浓度肝素钠刺激下以及在阿司匹林和肝素钠共同作用下对血小板超微结构变化,以求从多个角度观察肝素钠或阿司匹林和肝素钠对血小板的激活现象。因为在前面实验中可见肝素钠与血小板共孵育20分钟时血小板活化现象最明显,所以在这组研究中我们取药物孵育20分钟作为观察时间点。人新鲜机采血小板悬液6份,每份7ml,每份平均分成七组,分别给予:①～④血小板原液37℃预孵育5分钟,然后分别加肝素钠1IU/mL-4IU/mL;⑤ASA(终浓度同前)37℃预孵育5分钟后加肝素钠4IU/L;⑥ASA(终浓度同前)和A2P5P (终浓度同前)37℃预孵育5分钟后肝素钠4IU/mL;共同置于37℃水浴箱孵育20分钟⑦血小板原液(空白对照组)37℃水浴箱孵育25分钟。后各管加入等量0.3 %戊二醛固定液,混匀,室温下固定10 min,2000 r·min-1离心8 min ,弃上清液,再加入4 %戊二醛固定液室温固定30min。轻轻拨出试管内表面的黄膜,0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次,将黄膜修成1.5×2mm小块,再放入3%的缓冲戊二醛液内4℃下固定3h。1%锇酸后固定2h。乙醇系列脱水,丙酮置换,环氧树脂Epon812包埋,超薄切片,醋酸铀及硝酸铅双重染色,观察细胞超微结构并拍照。血小板聚集的测定应用阻抗法,每次检测记录血小板最大聚集?值及5分钟时血小板残余聚集?值;同一份标本上机检测两次,记录两次检测结果平均值;血小板采集到检测最长时间为2小时。结果:1肝素钠增强ADP诱导的血小板聚集兔血小板聚集检测显示,基线水平时静脉注射肝素钠后(8.88±2.88)ADP诱导的血小板聚集较注射前(6.82±2.28)明显升高,AA诱导的血小板聚集无明显变化,提示肝素钠增强兔ADP诱导的血小板聚集。在兔试验得出初步结论后,我们进一步研究了人血小板在受到肝素钠刺激后的反应。我们观察了不同浓度的肝素钠分别加入血小板悬液中孵育10分钟和20分钟时ADP诱导的血小板聚集的变化。结果表明, 4IU/mL肝素钠孵育组孵育10分钟血小板聚集较空白对照组明显升高(P<0.05),提示在高浓度肝素钠存在10分钟时血小板已被激活。孵育20分钟组中,1IU/mL～4IU/mL的肝素钠所致ADP诱导的血小板聚集均较空白对照组明显升高(P<0.05),仍以浓度为4IU/mL的肝素钠作用最为显著。同时我们也记录两组中所有标本血小板聚集检测5分钟时?值,统计结果显示5分钟残余聚集与最大聚集的结果相似,以上均提示肝素钠增加ADP诱导的血小板聚集,并表现出剂量依赖性。同时,我们观察了不同浓度的肝素钠对血小板超微结构的影响,结果显示,正常组血小板呈盘型或椭圆形,少数细胞表面可以见到少而短小的突起,膜光滑完整;血小板内颗粒较多,随机分布在胞质中,开放管道系统和致密管道系统可见,有少数小泡扩张,糖原颗粒均匀分布在血小板内。肝素钠1IU/mL孵育组可见血小板膜仍保持完整,表面少量突起;可见糖原轻度积聚,余与正常组相比无明显变化。肝素钠2IU/mL孵育组可见伪足形成,糖原轻度聚积。观察肝素钠3IU/mL孵育组,视野内可见血小板内溢出的颗粒(脱颗粒现象),血小板形态不一,可见伪足,部分血小板膜缺失,有的血小板表面可见膜泡;血小板内颗粒较正常组减少,可见大的囊泡,糖原聚积;部分血小板表现出聚集倾向。而在给予肝素钠4IU/mL孵育后,视野内可见大量碎片及血小板内脱出颗粒,血小板形态大小不一,伪足多见,多数血小板膜不完整;血小板内α颗粒及致密颗粒减少,开放管道减少,出现大而不规则的囊泡,几乎每个血小板均可见到明显糖原积聚;可见聚集型血小板。2阿司匹林体外增强肝素钠相关ADP诱导的血小板聚集兔ADP诱导的血小板聚集检测显示,应用阿司匹林灌胃一周,给予肝素钠静脉注射后(9.93±3.03)较注射前(6.99±2.10)升高。达肝素钠组显示了同样结果,应用阿司匹林灌胃一周,给予达肝素钠静脉注射后20分钟与注射前相比,ADP诱导的血小板聚集明显升高。AA诱导的血小板聚集未见明显变化。在阿司匹林基础上加用氯吡咯雷合用给予兔灌胃一周,血小板聚集较单独应用阿司匹林明显降低,但是静脉注射肝素钠后较注射前仍有明显升高(P<0.05)。动物实验发现此现象后,我们接下来设计研究了肝素钠或阿司匹林和肝素钠对人血小板聚集的影响。研究分为四组,结果表明,与单独应用肝素钠孵育组相比,阿司匹林预孵育后再给予肝素钠孵育10分钟组血小板聚集明显升高(P<0.05);20分钟组ADP诱导的血小板聚集升高更加明显(P<0.05),提示阿司匹林可能增强肝素钠相关的ADP诱导的血小板聚集,尤以肝素钠孵育20分钟时影响更加突出。各组间5分钟残余血小板聚集的对比,结果与最大聚集率的结果相似。同时我们也观察了ASA和肝素钠共孵育后血小板超微结构的改变,透射电镜下发现,血小板外可见大量溢出的颗粒及大量碎片;血小板形状大小不一,表面可见伪足,部分血小板膜缺失及较多膜泡;血小板内颗粒减少,开放管道系统减少,大而不规则的囊泡多见;可见聚集型血小板。血小板呈活化表现。3 P2Y1受体拮抗剂A2P5P对肝素钠或阿司匹林和肝素钠相关ADP诱导的血小板聚集中的影响人血小板聚集检测中,加用P2Y1受体阻断剂A2P5P和阿司匹林共孵育5分钟后,应用4IU/mL肝素钠刺激血小板,孵育10分钟组结果显示,加用A2P5P与阿司匹林和肝素钠共孵育组(11.45±3.24)较阿司匹林和肝素钠合用组(18.18±4.33)相比,血小板聚集值均明显降低,但仍高于对照组,显示A2P5P已经开始并一定程度地抑制阿司匹林和肝素钠相关ADP诱导的血小板聚集。而在孵育20分钟组可以观察到,加用P2Y1受体拮抗剂A2P5P组(5.92±2.66)血小板聚集较10分钟时更低,与阿司匹林和肝素钠合用组(20.09±6.91)比较差异更加显著,而且与对照组(8.86±3.85)相比亦明显降低,提示A2P5P 300umol/l在20分钟可完全抑制阿司匹林和肝素钠相关的ADP诱导的血小板活化。各组间5分钟残余血小板聚集的对比,结果与最大聚集的结果相似。P2Y1受体阻滞剂A2P5P和肝素钠共孵育组与单独应用肝素钠孵育组相比,孵育10分钟时,ADP诱导的血小板聚集明显降低(P<0.05),提示P2Y1受体拮抗剂A2P5P可以抑制肝素钠相关的ADP诱导的血小板聚集。应用A2P5P和阿司匹林预孵育再给予UFH共孵育,观察血小板超微结构,可见血小板形状基本规则,呈圆形或长椭圆形,大部分血小板膜完整,血小板内颗粒较多,除可见少量膜泡和少量糖原积聚外,未见其它异常表现。未见聚集型血小板及血小板聚集倾向。4 P2Y12受体在肝素钠或阿司匹林和肝素钠相关的ADP诱导的血小板聚集中的作用应用流式细胞术检测VASP磷酸化值,计算并比较其PRI,结果表明,肝素钠单独孵育组与生理盐水对照组比较,PRI指数明显升高,提示在肝素钠作用下,P2Y12受体开放,也即肝素钠增强ADP诱导的血小板聚集的增加与P2Y12途径相关;在动物试验中,氯吡咯雷组单独给予氯吡咯雷灌胃后,静脉注射肝素钠后与静脉注射肝素钠前相比,ADP诱导的血小板聚集呈下降趋势,也印证了这一点。VASP磷酸化检测显示给予阿司匹林与肝素钠共孵育组与单独应用肝素钠孵育组相比,无明显统计学差异,提示阿司匹林增强肝素钠相关ADP诱导的血小板聚集效应与P2Y12受体关联不大。结论:肝素钠增强ADP诱导的血小板聚集,呈剂量依赖性,肝素钠增强ADP诱导的血小板聚集可能与ADP P2Y1和P2Y12途径均相关;阿司匹林增强肝素相关ADP诱导的血小板聚集,这种效应可能主要与ADP P2Y1受体途径相关。