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目的本课题通过体外和体内实验研究蒲公英多糖(Polysaccharide from T.mongolicum,PTM)对乳腺癌生物学行为的影响,旨在明确蒲公英多糖抗乳腺癌的作用机制,从而为其应用于临床乳腺癌治疗提供实验依据。方法(1)采用超声法初步提取蒲公英多糖,同时计算蒲公英多糖的产率。随后,运用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)进行进一步提取,分别设置提取温度(40℃、50℃、60℃),液固比(6mL/g、12mL/g、18mL/g)和提取时间(30min、40min、50min)三个变量进行HPLC,采用中心组合实验(box-behnken design,BBD)分析三个变量(提取温度,液固比和提取时间)对蒲公英多糖(polysaccharides from T.mongolicum,PTM)提取率的影响。(2)将0(DMSO)、25、50、100、200、400μg/mL蒲公英多糖分别作用于MCF-7细胞,克隆形成实验检测细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞的凋亡率,western blot法检测细胞中P53、Bax、Bcl-2蛋白表达。(3)建立乳腺癌MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型。将50只移植瘤小鼠随机分为5组,每组10只:Control组(经胃给予0.9%生理盐水)、Capecitabine组(经胃给予卡培他滨)、20mg/kgPTM组(胃给予20mg/kg蒲公英多糖)、40 mg/kg PTM组(经胃给予40 mg/kg蒲公英多糖)、80 mg/kg PTM组(经胃给予80 mg/kg蒲公英多糖)。各组裸鼠经胃给药21天后处死,期间每3天运用游标卡尺测量各组裸鼠移植瘤的长度以及宽度,计算肿瘤体积。各组裸鼠经胃给药21天后采用颈椎脱臼法处死裸鼠,取移植瘤称重。运用免疫组化法检测各组移植瘤组织中P53、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果(1)模型适应性分析结果显示,PTM的提取率在3.12～4.65%之间,在提取温度60℃,液固比18:1,提取时间40min时达到最高。所建立的模型具有显著性(P<0.0001,F= 573.3965)。高的 R2(0.9986)和 R2adj(0.9969)表明模型有较好的拟合度。相对变异系数(CV)值为0.7652表明实验数据有较高的精密度和良好的可靠性。此外,单因素变量A,B,C,交互变量AB,AC,BC和二次方变量A2,B2,C2均显著影响PTM的提取率(P<0.05)。最佳的提取条件通过软件得出:提取温度58.17℃,液固比15.03:1,提取时间44.12min,在这个条件下的多糖提取得率的预测值为4.84%。为了验证模型的准确性,实验条件调整为:提取温度58.2℃,液固比15:1,提取时间44.12 min。在这个条件下提取PTM得率为4.86±0.13%。结果表明响应面法用于提取PTM条件的优化是有效和合适的。(2)克隆形成实验结果表明,随着蒲公英多糖浓度的升高,软琼脂中克隆形成数量逐渐下降;与0 μg/mL组相比,当蒲公英多糖浓度为50、100、200、400μg/mL时克隆形成数量明显降低(P<0.05)。MTT法检测结果表明,随着蒲公英多糖浓度的升高,MCF-7细胞的增殖活性逐渐降低;与0 μg/mL组相比,当蒲公英多糖浓度为50、100、200、400μg/mL时MCF-7细胞的增殖活性明显降低(P<0.05)。随着蒲公英多糖作用时间的延长,MCF-7细胞的增殖活性逐渐降低,与Oh时相比显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,随着蒲公英多糖浓度的升高,细胞凋亡数量逐渐增多;与0 μg/mL组相比,当蒲公英多糖浓度为50、100、200、400μg/mL时细胞凋亡的数量明显增多(P<0.05)。western blot检测结果表明,随着蒲公英多糖浓度的升高,MCF-7细胞中P53蛋白的表达水平逐渐增高,蒲公英多糖各浓度组细胞中P53蛋白的含量与control组相比明显上升(P<0.05)。随着蒲公英多糖浓度的升高,MCF-7细胞中Bax蛋白的表达水平逐渐增高,蒲公英多糖各浓度组细胞中Bax蛋白的含量与control组相比发生明显上调(P<0.05)。随着蒲公英多糖浓度的升高,MCF-7细胞中Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低,蒲公英多糖各浓度组细胞中Bcl-2蛋白的含量与control组相比明显减少(P<0.05)。(3)将人乳腺癌MCF-7细胞接种至裸鼠右肩甲皮下第8天时,裸鼠该部位即可见有黄豆大小的移植瘤,本实验中50只裸鼠均全部成瘤。在裸鼠成瘤之后,各组裸鼠在进食和饮水上均为正常,大小便亦未发生异常。各组裸鼠的精神状态良好,活动正常,反应迅速。各组裸鼠肤色正常、移植瘤组织未发生破溃。上述结果表明乳腺癌MCF-7移植瘤裸鼠模型构建成功。各时间点Capecitabine组、20、40、80mg/kgPTM组裸鼠移植瘤体积均明显小于 Control 组(P<0.05)。与 Capecitabine 组相比,40mg/kgPTM 组和80mg/kgPTM组各时间点裸鼠移植瘤体积明显减小(P<0.05)。而40 mg/kg PTM组与80 mg/kg PTM组各时间点裸鼠移植瘤体积差异无统计学意义(P<0.05)。与 Control 组相比,Capecitabine 组、20、40、80 mg/kg PTM组裸鼠移植瘤重量均明显减轻(P<0.05)。与Capecitabine组相比,80mg/kg PTM组裸鼠移植瘤重量无统计学差异(P>0.05)。P53蛋白染色的阳性部位主要分布于裸鼠移植瘤细胞核中,呈棕黄色颗粒状。与Control组相比,20、40、80 mg/kg PTM组裸鼠移植瘤组织中P53蛋白的表达水平明显的增高(P<0.05);随着PTM作用浓度的升高,P53蛋白的表达量也逐渐升高。Bax蛋白的染色阳性部位定位于裸鼠移植瘤的细胞浆,呈棕黄色颗粒状。与Control组相比,20、40、80 mg/kg PTM组裸鼠移植瘤组织中Bax蛋白的表达水平明显的增高(P<0.05);随着PTM作用浓度的升高,Bax蛋白的表达量也逐渐升高。Bcl-2蛋白阳性染色主要分布于裸鼠移植瘤的细胞浆中。呈棕黄色颗粒状;随着PTM作用浓度的升高,Bcl-2蛋白的表达量也逐渐降低。结论蒲公英多糖通过促进P53和Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达来诱导乳腺癌细胞凋亡,抑制其增殖,从而发挥体内抗乳腺癌作用。