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在真核生物中DNA缠绕在组蛋白上形成染色质的基本组成结构——核小体。组蛋白上可以发生多种共价修饰。这些修饰在转录调控、DNA损伤修复、DNA复制、染色体浓缩以及mRNA可变剪切等依赖于染色质的生物化学过程中起着重要的作用并;通过这些生物化学过程影响多种生物学过程和疾病发生过程。发生在赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)上的甲基化是其中最重要的修饰之一。
与动物中研究相比,植物中组蛋白甲基化的功能研究起步较晚,相应的组蛋白甲基转移酶、去甲基化酶以及结合甲基化组蛋白的效应因子也知之甚少。分离和鉴定参与甲基化修饰的因子是植物表观遗传学中最重要和最基本的科学问题之一。本论文致力于在模式植物拟南芥中鉴定组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶,并对其生物学功能进行深入的研究,以期揭示组蛋白甲基化介导的表观遗传调控在植物生长发育和响应环境过程中的功能和作用机制。
含有JmjC结构域的蛋白是后生动物中一类最主要的组蛋白去甲基化酶,该类蛋白在拟南芥中有21个。我们通过对其辅助因子结合位点氨基酸的保守性分析,发现其中有15个可能具有酶活性;进化分析表明人中KDM6/JMJD3、KDM2/JHDM1和PHF亚家族在拟南芥和水稻中没有同源蛋白。
为了深入研究组蛋白去甲基化对植物发育的影响,我们首先建立了一个植物细胞内组蛋白去甲基化酶活性检测体系,并利用该体系分析了拟南芥中含有JmjC结构域蛋白的组蛋白去甲基化酶活性和位点特异性,成功地鉴定了两个H3K4me3/2/1去甲基化酶(JMJ14和JMJl5)、一个H3K9me2/1去甲基化酶(IBM1,也叫JMJ25)以及一个H3K27me3/2去甲基化酶(REF6,也叫JMJ12)。
通过上述植物细胞内组蛋白去甲基化酶活性检测体系检测,我们发现JMJ14可以去甲基化H3K4me3、H3K4me2和H3K4me1。在体外,HA抗体免疫纯化的JMJ14-YFP-HA也可以去甲基化H3K4me3、H3K4me2和H3K4me1。JMJ14突变导致植物在长短日照条件下都表现为早花。我们的研究结果表明jmj14突变体的早花表型是由于开花整合因子FT、SOC1、AP1和LFY表达上升造成的。
PcG介导的H3K27me3在基因沉默和发育调控中起着至关重要的作用。已有研究表明拟南芥中H3K27me3是由PRC2复合体中EZH2同源蛋白CLF、SWN和MEA催化,LHP1通过结合H3K27me3来有效地抑制基因表达。前人研究发现植物中超过7,000个基因上具有H3K27me3修饰,并且该修饰可以被主动去除,但是其去除的机理一直未知。进化分析表明人H3K27me3去甲基化酶KDM6/JMJD3亚家族在植物中不存在,因此无法通过基因同源性直接鉴定。
我们通过上述植物细胞内组蛋白去甲基化酶活性检测体系证明,REF6可以特异性地去除H3K27me3和H3K27me2。过表达REF6的植物表现出早花、叶子上卷、顶端成花等多种发育缺陷表型,这些表型与LHP1和PRC2核心成员EMF2这两个H3K27me3沉默相关重要基因的功能缺陷突变体具有很高相似性,这种相似性还体现在细胞和基因表达水平上。与上述观察一致的是,我们发现在REF6过表达植株中组蛋白赖氨酸甲基化只有H3K27me3和H3K27me2发生特异性下降。Ref6和H3K27me3甲基转移酶缺陷的clf swn组成的三突变体的表型与clf swn相同,表明clf swn对ref6表现上位效应;ref6 clf双突变体在叶上卷和育性下降等多个方面的表型比clf突变体弱,表明ref6可以部分回复clf的表型。分子水平上的变化与表型上的变化一致。Clf中H3K27me3发生部分下降,当再缺失一个H3K27me3去甲基化酶后,H3K27me3水平部分回复从而使得其表型变弱。上述遗传学研究进一步表明REF6和H3K27me3甲基转移酶起着相互拮抗的功能。我们通过H3K27me3 ChlP-seq分析找到了656个基因上H3K27me3水平上升到原来的3倍以上。这些基因中最富集的为发育相关及各种刺激响应相关基因,它们多数为REF6的直接靶基因。通过转录组分析我们发现这些基因上H3K27me3水平上升与其转录抑制呈正相关。先前报道表明其中6个基因可以受到植物激素油菜素内酯诱导,我们证明这些基因在ref6突变体中H3K27me3修饰水平上升并且表达量下降。因此说明激素信号激活基因表达需要通过REF6去除抑制性的H3K27me3修饰来实现,并且这可能是植物基因转录激活过程中的一个重要机制。我们的工作还证明植物和后生动物中H3K27me3的调控机制是保守的,但是不同亚家族的酶参与了这个过程。
本论文的另一部分研究是通过生物化学方法从花椰菜中纯化鉴定了两个组蛋白精氨酸甲基转移酶——PHRMT5和PHRMT10,并研究了这两个酶的拟南芥同源蛋白AtPRMT5和AtPRMT10的生物学功能。我们的研究发现AtPRMT5和AtPRMT10可以分别催化组蛋白H4R3位点的对称型和非对称型双甲基化,并有独特的生物化学活性。AtPRMT5和AtPRMT10可以通过两条独立的通路负调控重要开花抑制因子FLC来调节开花时间。