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课题组前期研究表明,源于黑米皮花青素混合物(Black Rice Anthocyanidin,BRACs)对MDA-MB-453乳腺癌细胞(HER-2+)的生长和转移有显著的抑制作用,对MCF-10A细胞(正常乳腺上皮细胞)几乎无细胞毒性作用,对MCF-7细胞(HER-2—)毒性作用较小。作为花青素的主要活性单体,飞燕草素(Delphinidin,Dp)对MDA-MB-453细胞是否具有较强的抑制效应,其机制是什么?目前尚不清楚。自噬和凋亡是调控肿瘤细胞死亡的两种主要程序,而自噬是细胞处于恶性微环境时表现的一种应激性反应,既能保护细胞免于凋亡也可能促进细胞死亡,具有双刃剑作用。研究发现,飞燕草素能诱导小鼠成纤维细胞产生保护性自噬;饥饿状态诱导的自噬能通过维持氮循环促进细胞存活,降低乳腺癌患者生存期;体外3D培养显示,肿瘤细胞转移过程中,肿瘤细胞可通过自噬途径而存活。m TOR和AMPK信号通路作为调节细胞自噬的两条经典途径,与细胞生长和能量代谢密切相关,低氧状态活化AMPK或抑制m TOR受体诱导的自噬能促进乳腺癌细胞存活,内质网应激途径可通过抑制AKT/m TOR活性诱导自噬。因而,飞燕草素对HER-2受体阳性乳腺癌是否发挥抑制作用,以及自噬通过m TOR和AMPK通路在其中是否发挥重要作用,值得研究。目的在课题组前期研究基础上进一步探讨飞燕草素对HER-2受体阳性乳腺癌细胞的抑制效应,以及自噬在其中发挥的作用,明确飞燕草素抗HER-2受体阳性乳腺癌作用,从细胞应答自噬的角度为HER-2受体阳性乳腺癌的防治提供新措施。材料与方法以MDA-MB-453细胞(HER-2+)为研究对象,不同浓度的飞燕草素处理细胞:(1)增殖能力:CCK8方法;(2)细胞凋亡:TUNEL法;(3)凋亡起始调控蛋白caspase-3/9的活性:Western Blot法;(3)自噬鉴定:透射电子显微镜检测细胞内自噬泡,GFP-LC3质粒转染检测自噬标志蛋白LC3-II,免疫荧光实验检测LC3-I/II蛋白聚集,Western Blot检测自噬标志蛋白LC3-II、自噬体膜调控蛋白Atg5-Atg12的活性。(4)飞燕草素诱导MDA-MB-453细胞自噬的分子机制:Western Blot检验m TOR信号通路蛋白(AKT/p-APK、m TOR/p-m TOR、p70s6k/p-p70s6k、e IF4e/p-e IF4e)和AMPK信号通路蛋白(ULK1/p-ULK1、LKB1/p-LKB1、AMPK/p-AMPK、FOXO3a/p-FOXO3a)的表达或活性。(5)自噬抑制效应的检测:自噬早期抑制剂3-MA(5 mmol/L)预处理细胞2.5 h,再以80μmol/L的飞燕草素处理48 h,GFP-LC3质粒转染检测荧光蛋白LC3-II,免疫荧光实验检测细胞内LC3-I/II蛋白聚集,Western Blot实验检测细胞内LC3-I/II蛋白;CCK8实验检测细胞增殖活性;TUNEL实验检测细胞凋亡。结果(1)飞燕草素能有效抑制HER-2受体阳性型乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖;增加TUNEL凋亡细胞数;上调裂解的caspase-3/9蛋白表达。(2)飞燕草素增加GFP-LC3荧光斑点数;LC3蛋白免疫荧光表达;自噬泡形成;LC3-I/II蛋白转化;自噬体膜调控蛋白Atg5-Atg12表达。(3)飞燕草素下调m TOR通路中AKT、m TOR、e IF4E和p70s6k蛋白的活性;上调AMPK通路中LKB1、AMPK、FOXO3a与ULK1蛋白的磷酸化水平。(4)3-MA抑制GFP-LC3荧光斑点形成和LC3-I/II蛋白转化;自噬抑制促进MDA-MB-453细胞增殖抑制和凋亡效应。结论飞燕草素能有效抗HER-2受体阳性型MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖,促进细胞caspase-3/9依赖性凋亡,同时诱导保护性自噬;飞燕草素通过抑制m TOR通路和激活AMPK通路诱导HER-2受体阳性型MDA-MB-453乳腺癌细胞自噬;抑制自噬能增敏飞燕草素抗HER-2受体阳性型MDA-MB-453乳腺癌细胞效应。