【摘 要】
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鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染所致的症状是腹膜炎及出血性肠炎等炎症性损伤,但其炎症发生机制尚未知。前期研究表明,SVCV感染黑头软口鲦上皮瘤细
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鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染所致的症状是腹膜炎及出血性肠炎等炎症性损伤,但其炎症发生机制尚未知。前期研究表明,SVCV感染黑头软口鲦上皮瘤细胞(Epithelioma Papulosum Cyprini,EPC)破坏线粒体结构,影响线粒体复合体III的功能,导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS),尤其是H2O2的蓄积。ROS可以激活炎症信号系统,引发炎症反应。为此,本文从ROS角度,探究SVCV诱发炎症的病理机制。主要研究结果如下:1. SVCV-ROS-炎症之间的关系用0.1 MOI的SVCV感染EPC细胞,以0.5 m M的H2O2和1μg/m L的LPS为阳性对照,分别在感染后1、3、6、12以及24 h收集细胞,分析炎症因子的表达。结果显示,SVCV感染诱导TNF-ɑ和COX-2的高表达,与阳性对照H2O2和LPS处理的结果一致;SVCV感染后3 h和6 h诱导IL-8的表达上调,H2O2在1 h和3 h诱导IL-8的表达上调,LPS在1 h诱导IL-8表达上调;SVCV在感染后3 h抗炎基因IL-10表达上调,之后下调,而H2O2处理持续诱导IL-10的高表达,LPS则是早期抑制IL-10表达,晚期上调IL-10表达。蛋白水平上也验证了SVCV和H2O2诱导COX-2的表达,其趋势一致。这些结果说明SVCV可以诱发炎症反应,同H2O2诱发的炎症因子表达模式相似。抗氧化剂NAC可显著降低SVCV和H2O2诱导的TNF-ɑ和COX-2的表达,说明了ROS与SVCV诱发的炎症反应相关。2. SVCV诱发炎症反应的分子机制为了验证SVCV诱发炎症反应的详细通路,我们分别从NF-κB、MAPK/AP-1以及PI3K信号通路上进行验证。(1)NF-κB途径:通过双荧光素酶报告实验验证病毒感染后的NF-κB启动子活性,证实SVCV不能激活NF-κB启动子,且NF-κB的抑制剂PDTC处理不影响SVCV诱导的炎症因子的表达,说明在EPC细胞中,NF-κB不参与SVCV诱发的炎症反应。(2)MAPK途径:用MAPK通路的各抑制剂分别处理细胞,验证MAPK/AP-1通路,结果表明抑制JNK通路后,可显著抑制SVCV诱导的COX-2和IL-8的表达,使之分别下调74%和47.3%,并使IL-10的表达上调1.4倍;抑制ERK通路后,可显著抑制SVCV诱导的COX-2和TNF-α的表达,分别下调29.2%和51.9%,并使IL-10的表达上调3.2倍;抑制p38MAPK通路后,可显著抑制SVCV诱导的TNF-α的表达(72.9%)。(3)PI3K途径:用PI3K抑制剂LY294002处理细胞验证PI3K通路,结果说明SVCV可以通过PI3K通路诱发趋化因子IL-8的产生。此外,我们发现抑制MAPK和PI3K通路可促进SVCV的复制。
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