对虾的养殖是我国重要的水产支柱产业。但是近年来的病害和环境污染使对虾养殖业遭受巨大的损失。因此,深入研究对虾的先天免疫防御机制,对于控制对虾疾病具有重要的意义。对虾主要依赖先天免疫来防御外来病原微生物的入侵。免疫缺陷(Immune deficiency, IMD)和Toll信号通路在调控对虾免疫系统抵御外来微生物的感染中起到关键的作用。对虾中的核因子活化B细胞K轻链增强子(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)通路中很多的关键元件已经被发现,并对它们的主要功能进行了研究。Akirin作为一种新的NF-κB信号通路转录辅助因子,在果蝇和哺乳动物中均有发现,其从无脊椎动物到脊椎动物中都具有高度保守性。在哺乳动物中,Akirin家族有两组同系物为Akirinl和Akirin2,在无脊椎动物中只有一个Akirin基因,并与脊椎动物中的Akirin2具有高度同源性。作为一种核因子,Akirin在多种生物过程中具有重要的功能,例如免疫反应,骨骼肌发生,胚胎发育和肿瘤转移。在果蝇的免疫缺陷(IMD)信号通路(与哺乳动物的肿瘤坏死因子受体(TNFR)信号通路相似)中,Akirin可以促进NF-κB因子的转录。有些研究显示,在Akirin2敲降的小鼠中,使用TLR、IL-1p和TNFa刺激后,NF-κB转录的目的基因受到明显的抑制。进一步地研究表明,染色质重塑SWI/SNF复合物中的Brahma相关60千道尔顿蛋白(Brahma-associated protein of 60 kDa, Bap60)可以与Akirin相互作用,参加果蝇的免疫防御。哺乳动物中,Akirin2作为桥梁与NF-κB, SWI/SNF复合物中的BRG1相关60千道尔顿因子(BRG1-Associated Factor 60kDa, BAF60)和IκB-ζ组合成复合物,该复合物调节NF-κB p50的转录活性,在抵御病毒和细菌感染中发挥作用。Akirin序列中没有明显的DNA或者RNA结合基序,其与NF-κB和其上游信号分子之间存在一种潜在的联系。因此Akirin在NF-κB信号通路中的作用机理需要进一步研究。本文研究了日本囊对虾Akirin及其相互作用基因在对虾免疫防御中的功能。日本囊对虾Akirin的cDNA全长为1448 bp,其中645 bp编码214个氨基酸的开放阅读框。序列分析显示其包含2个核定位信号,分别为26～30位(KRRRC)和78～81位(KRRK)。日本囊对虾Bap60的cDNA全长为1827 bp,1593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。序列中包含1个SWI复合物结构域。日本囊对虾的14-3-3ζ的cDNA全长为2098 bp,其中741 bp编码246个氨基酸的开放阅读框。ExPASy预测14-3-3ζ的理论等电点为4.65,分子量为27.9 KDa。对不同生物中的Akirin, Bap60和14-3-3氨基酸进行比对分析,显示均具有较高的相似性。Akirin主要表达于日本囊对虾的血细胞、心脏和肠中。在革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激之后,Akirin表现为表达上调,但在革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌刺激之后,Akirin的表达几乎没有变化。这提示了在日本囊对虾中,Akirin主要在应对革兰氏阴性菌感染的免疫防御中发挥作用。我们推测Akirin通过IMD信号通路来对抗革兰氏阴性菌的感染。为了确定在对虾中Akirin确实参与IMD途径的调控,我们利用RNA干扰的方法敲低IMD转录因子Relish的表达,再感染弧菌,检测了九种抗菌肽的表达,包括五种抗脂多糖因子(antilipopolysaccharide factors, alfs)、两种甲壳肽(Crustins)、一种溶菌酶(Lysozyme)和一种对虾素(penaeidin, pen)。发现在革兰氏阴性菌刺激后,alf-b1, alf-c1, alf-c2, alf-d2和Pen2五种抗菌肽的表达受到了抑制。说明IMD途径在革兰氏阴性菌刺激条件下,调控这五种抗菌肽的转录。利用RNA干扰的方法敲低Akirin的表达后,再感染弧菌,检测抗菌肽的表达,发现受IMD-Relish调控的抗菌肽alf-b1, alf-c2和alf-d2的表达也被抑制,推测Akirin可能与Relish协同作用,调控这些抗菌肽的表达。利用下拉(Pull-down)实验证明在体外Akirin可以与Relish的IPT结构域相互作用。根据Akirin可能与Braham (SWI/SNF) ATP依赖的染色质重塑复合物中的Bap60亚基结合,调控IMD信号通路的报道。我们克隆了对虾SWI/SNF染色质重塑复合物的Bap60亚基。进一步利用RNA干扰的方法敲降其表达并感染弧菌,结果显示与Akirin敲降后的对虾中抗菌肽表达抑制的情况是一致的。Pull-down实验显示Akirin可以与Bap60相互作用。因此,Akirin可以与Braham (SWI/SNF)ATP-依赖的染色质重塑复合物中的Bap60亚基以及Relish协同作用,通过调控多种抗菌肽的表达清除病原菌。另外,序列分析发现日本囊对虾Akirin序列中含有一个与14-3-3蛋白相互作用的位点(SPP), Pull-down和免疫共沉淀实验验证了Akirin具有与14-3-3结合的功能。同时,14-3-3也可以与Relish的RHD结构域相互作用。在干扰Akirin的对虾用鳗弧菌感染后,与对照相比抗脂多糖因子等抗菌肽的表达显著下调,而干扰14-3-3的对虾用鳗弧菌刺激后,多种脂多糖因子的表达呈现上调。综合以上的结果,Akirin可以与Relish协同作用参加IMD-Relish信号通路,当Akirin与Bap60结合后,具有正调控Akirin-Relish信号通路的功能；在Akirin与14-3-3ζ蛋白作用后,具有负调控Akirin-Relish信号通路的功能。