目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)作为一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,多见于我国南方及东南亚地区,尤其高发于广东省,素有“广东瘤”之称。由于鼻咽癌具有发病隐匿、转移早、个体差异大的特点,尽管目前以调强放射治疗为主的综合治疗可以使鼻咽局部有较好的控制,但鼻咽癌的五年生存率始终徘徊在70%左右,因而针对性的肿瘤个体化治疗成为大势所趋。然而,个体化治疗需建立在精确的分子标志物表达谱分析和差异基因的功能研究的理论基础上。因此筛选出与鼻咽癌的局部侵犯、远处转移、血管生成等肿瘤生物学行为密切相关的表达谱,通过对其中重要分子标志物的功能和调控通路研究,能进一步明确鼻咽癌发生发展的分子机制,有助于制定出鼻咽癌的个体化治疗方案,这对于提高鼻咽癌患者生存率,生存质量、降低治疗成本具有极其重要的临床意义。miRNA是一类非编码单链小分子RNA,长约18-24个核苷酸,通过与多个靶基因mRNA的3’非翻译区不完全互补配对,在转录后水平抑制基因表达。目前研究表明50%以上的miRNA定位在肿瘤相关基因组区域,不但扮演原癌基因或抑癌基因的角色,还通过多条信号通路调控肿瘤的浸润和转移,广泛的参与了肿瘤的发生和发展,成为近10年来肿瘤研究领域的热点之一。近些年愈来愈多的研究发现,miRNA的肿瘤调控作用通过庞大的调控网络得以实现,并且这类网络分析通常建立在表达谱筛选的基础上。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤中,癌基因SETD1A通过miR-30、miR-590-5p作用网络进行对抑癌基因p53的调控。在胰腺癌中,经过筛选所得的miR-21、miR-23a、和miR-27a与抑癌基因PDCD4,、BTG2、和NEDD4L构成相互作用网络,共同调节胰腺癌的增殖、侵袭和转移。这些研究均表明,miRNA调控网络对肿瘤发生发展具有重要作用,并可作为潜在的治疗靶标。在鼻咽癌中,目前研究发现多个miRNA参与了鼻咽癌的发病机制,其表达失调可影响鼻咽癌细胞的增殖、凋亡、运动、侵袭和转移能力,并与鼻咽癌病人的预后密切相关。miR-26在鼻咽癌细胞系及鼻咽癌组织标本中表达下调,靶向EZH2参与抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭作用。同样的,miR-9在鼻咽癌表达下调,并通过靶向CXCR4调控鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。截至2016年,已有超过30个microRNA参与鼻咽癌疾病发生及发展。然而,根据检索文献和本课题组目前关于鼻咽癌组织中的miRNA的功能及机制研究,发现在已有的研究中,缺乏对以组织差异miRNA表达谱为中心的全方位多层次调控网络分析,因而本研究将结合高通量测序技术与生物信息学分析对鼻咽癌组织中miRNA表达谱及以miRNA为中心的调控网络进行全面而系统的分析。为了让筛选出的差异miRNA表达谱具有更好的代表性和重复性,本研究利用激光显微切割技术(LCM, laser capture microdissection),纯化鼻咽癌组织标本中的肿瘤细胞。并进一步通过新一代测序技术又称高通量测序技术,筛选得到更加精准的差异miRNA表达谱。再将所得的鼻咽癌组织差异miRNA表达谱为基础,结合生物信息学方法分析miRNA调控网络。在本研究中,除了常规的GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路注释分析方法,进一步增加了信号通路分析(IPA,Ingenuity pathway analysis)。其中GO和KEGG分析着重于分析靶基因的功能分布,IPA则在网络构建方面具有不可取代的优势。在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤中均有研究表明利用IPA构建的miRNA调控网络可以在揭示肿瘤分子机制、指导治疗及评估预后方面发挥重要作用。然而目前在鼻咽癌组织的差异miRNA表达谱研究中,尚无利用IPA构建miRNA调控网络的先例。关于miRNA在鼻咽癌中通过何种调控网络调节肿瘤的发生发展过程值得我们进行深入的探讨。所以,本课题的目的在于筛选出鼻咽癌组织与正常组织间的差异miRNA表达谱,利用生物信息学分析预测靶基因的功能分布,并构建以miRNA为中心的调控网络,旨在从更加全面和深层的角度分析肿瘤的发病及发展机制,从而为进一步改善鼻咽癌患者的治疗、预后奠定理论基础。材料和方法1.临床资料1.112例鼻咽癌组织和8例非癌鼻咽上皮组织用于LCM和高通量测序。所有组织均经病理学检查确诊,鼻咽癌患者在活检前均未接受放化疗等治疗。鼻咽癌组中病例的临床分期分布、年龄分布和性别比例与鼻咽癌临床特点相一致,并按照相近的年龄分布与性别比例筛选对照组病例。1.2201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织用于高通量测序结果的qPCR验证。病例的临床资料筛选标准同上,其中65例鼻咽癌组织和20例非癌鼻咽上皮组织用于初步验证,检测miRNA与临床分期及TNM分期间的相关性通过将样本量扩大至201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织。2.组织标本的收集和冰冻切片的制作组织标本在活检术后立即放入液氮中长期冻存。冰冻切片在-21℃-25℃之间进行,选取组织最大横切面,调整切片厚度为8um,每个样品连续缓慢切片18-20张后,在无水乙醇中固定10min。然后经过漂洗、苏木素染色、分化、伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明等简易H&E染色步骤制作LCM所需切片。3.激光显微切割(LCM)装置好玻片及配套样品收集离心管,在10倍或20倍镜下圈出目的区域,如癌巢或者正常鼻咽上皮,于10倍镜下进行切割,利用收集离心管管盖将切割后的目的组织片进行粘附收集。切取完毕后在离心管内加入100ulRNAlater。然后放于-80℃低温冰箱中保存。4.组织总RNA抽提及质量监控按照Trizol和RNAiso Plus的protocol依次进行组织RNA的提取。分别利用Agilent 2100生物分析仪和ND-1000微量核酸定量仪检测所得总RNA质量,检测样品的总量、RIN值(RNA Integrity Number)、28S/18S以及OD260/OD280数据,用于评判样品RNA质量。通过质量检测的RNA用于下一步测序建库及荧光定量PCR检测。5.文库构建与高通量测序。根据华大TruSeq Small RNA样品准备流程,将通过磁珠分离的小RNA和配体利用逆转录酶和随机引物逆转录成cDNA,并进行PCR扩增,所得文库经Agilent 2100生物分析仪检测后便可用于高通量测序。高通量测序使用Illumina Hiseq 2000测序平台,对肿瘤样品和对照非肿瘤样品采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)方式,将所得数据经过滤过、匹配和鉴定,再利用Genespring软件筛选Fold change≥2且具有统计学意义的差异miRNA。miRNA表达量的单位为TPM(transcripts per million,公式为：单一miRNA reads数×10^6/总reads数)6.荧光定量PCR反应抽提鼻咽癌组织和非癌鼻咽上皮组织的总RNA,以稀释4-5倍的cDNA为模板,U6 snRNA为内对照,采用SYBR green法进行PCR扩增,通过相对定量2-△cp值代表miRNA的相对表达水平。7.靶基因预测、GO分析、KEGG通路分析。运用预测软件RNAhybrid、TargetScan、miRanda和PITA对差异miRNA进行靶基因预测,对结果进行重叠与筛选。筛选出的靶基因用于Gene Ontology (GO, http://www.geneontology.org/)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG, http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分析。8.IPA工作流程候选miRNA导入IPA在线数据库(http://www.ingenuity.com),软件会对差异表达miRNA进行靶基因预测,并对他们之间的联系可信度进行评分,然后再利用MicroRNA Target Filter功能选择与肿瘤相关的靶向作用关系,依据这些联系构建miRNA的调控网络。9.细胞培养人鼻咽癌细胞株CNE2采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗RPMI 1640培养基,在37℃、5%C02、饱和湿度的条件下传代培养。采用对数期生长的细胞用于实验。10. miRNA瞬时转染依照阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。6孔板中siRNA的转染量为20nM。11. Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后分别用6%和10%SDS-PAGE电泳,每泳道上样30μg蛋白样品,依次进行转膜、免疫杂交和化学发光法显影。12.统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。鼻咽癌组织和鼻咽非癌对照组织中差异miRNA平均表达水平的比较,以及miRNA在不同分期的鼻咽癌组织间的表达水平比较采用2-△Cp,miRNA瞬转效率的测定采用2-△△Cp。两组之间的数据比较通过两独立样本t检验(2 Independent Samples Tests)检测。三组或三组以上数据的比较采用单因素方差分析,方差齐性时,采用ANOVA,其多重比较采用LSD法；方差不齐时采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett T3。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.鼻咽癌组织中差异miRNA的筛选结合LCM技术与高通量测序对12例鼻咽癌组织和8例鼻咽非癌对照组织进行差异miRNA检测,将clean date进行比对,基于NCBI GenBank、Rfam(10.1)和mirbase21.0数据库,可以匹配到827个已知人源miRNA。将这827个niRNA的TPM值导入GeneSpring软件中进行运算后,得到由8个已知miRNA构成的鼻咽癌组织差异miRNA表达谱,其中包含4个上调miRNA(miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p和miR-27a-5p)和4个下调niRNA(miR-34c-5p、miR-375、 miR-92b-3p和miR-449c-5p)。它们在在NPC组和正常对照组间的表达差异倍数和相应的FDR值分别为miR-205-5p (fold change=3.9103, FDR<0.01), miR-92a-3p (fold change=4.5575, FDR<0.01), miR-193b-3p (fold change=257.719, FDR=0.03), miR-27a-5p (fold change=353.84, FDR=0.017), miR-34c-5p (fold change=-565.0915, FDR<0.01), miR-375 (fold change=-226.8843, FDR<0.01), miR-92b-3p (fold change=-10.7984, FDR<0.01), miR-449c-5p (fold change=-1968.9108, FDR<0.01)。根据所得的TPM值绘制热图和散点图,分析发现筛选出的差异miRNA表达谱可以对NPC组与鼻咽非癌对照组进行区分。这说明了我们筛选出来差异miRNA具有较好的组内重复性,可以在同种组织类型中得到重复。2.差异miRNA的qPCR验证与临床分期相关性分析利用qPCR对高通量测序所得的差异miRNA表达谱进行验证。经过验证得到7个具有统计学意义的差异miRNA,分别为miR-205-5p(t=-5.209,P0.001), miR-92a-3p(t=-4.457,P=0.001), miR-193b-3p(t=-3.64,P<0.001), miR-27a-5p(t=-2.977,P=0.005), miR-34c-5p(t=3.776,P=0.001), miR-375(t=2.179,P=0.004), miR-92b-3p(t=-1.297,P=0.198)和miR-449c-5p(t= 1.347,P=0.007).对照组进行比较,其中miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p、miR-27a-5p均为高表达,miR-34c-5p、miR-375和miR-449c-5p均为低表达,与高通量测序结果相一致。分析这7个miRNA与临床分期之间的相关性,发现仅有miR-34c-5p表现出与临床分期间明显的负相关调节,即随着临床分期的升高,其表达量逐步降低。将样本量扩大以进一步验证,得到miR-34c-5p的表达与患者T分期显著相关,且随着分期的增加,miR-34c-5p的表达逐渐降低(F=3.735,P<0.05)。与N分期、M分期无明显关联,同时,随着临床分期的增加,患者的miR-34c-5p的表达逐渐降低(F=4.985,P<0.05)。3.靶基因的预测及生物信息学分析。利用TargetScan、PITA、RNAhybrid和miRanda4个预测网站对通过验证的7个miRNA进行靶基因预测,结果进行重叠,得到共同的靶基因18454个。将这18454个重叠靶基因分为上调miRNA和下调miRNA的的预测靶基因两部分,从而筛选出上调的miRNA共同靶向的基因248个,下调miRNA的共同靶基因666个。将这2组靶基因用于GO和KEGG分析。GO分析由分子功能(molecular function)-.细胞组分和元件(cellular component)及参与的生物过程(biological process) 3个部分组成。分子功能中最多靶基因富集的功能为结合(binding),富集程度最高的成纤维细胞生长因子结合(Fibroblast growth factor binding)功能条目提示靶基因集中作用于促进新血管形成,修复损害的内皮细胞。而在细胞组分和元件部分靶基因与细胞及细胞部分(cell, cell apart)功能紧密相连,肌动蛋白细胞骨架(Cortical actin cytoskeleton)的Enrichment值最高,提示靶基因主要参与细胞的运动、分裂、粘附以及吞噬等过程。最后在生物过程中靶基因功能主要与细胞过程(cellular process)相关,参与IL-1的分泌(Interleukin-1 secretion)和免疫应答中肥大细胞的活化(Mast cell activation involved in immune response)。KEGG分析显示上调miRNA靶向的基因主要涉及的通路有磷酸肌醇代谢(Inositol phosphate metabolism)、磷酸肌醇信号系统(Phopphatidylinositol signaling system)和趋化因子信号通路(Chemokine signaling pathway)。而下调miRNA靶向的基因涉及的通路中,排名前3的分别是自然杀伤细胞介导的细胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、细胞因子与细胞因子间相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)以及抗原的加工与提呈(Antigen processing and presentation)。自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路在KEGG分析中涉及最多数目的预测靶基因,同时所占总体靶基因的比例也最高。在这条与抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节密切相关的通路中,有34个预测靶基因在其中起作用,其中有27个基因包括抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulin-like receptors, KIRs)家族基因可以作为]miR-34c-5p和miR-449c-5p的靶标。4.鼻咽癌miRNA调控网络分析通过IPA分析发现含有GGCAGUG序列的miR-34c-5p和niR-449c-5p在miRNA-mRNA相互作用网络中靶向的基因所占比例超过74%,进一步分析认为miR-34c-5p和miR-449c-5p与TP53、CCND1、BcI2、CDK6和MET这5个基因之间的作用关系是miRNA调控网络分析的关键点。其中TP53和Bcl2被认为是潜在的鼻咽癌诊断标记物,而CCND1可用于头颈部肿瘤的治疗疗效评估。它们的共同作用通路考虑为PI3K/AKT/mTOR信号通路,通过该信号通路对肿瘤细胞周期进行调控。选择与临床分期关系最为密切的miR-34c-5p,通过鼻咽癌细胞株瞬时转染与western blotting检测,确定miR-34c-5p与CCND1、Bcl2、CDK6和MET之间的靶向关系。结合文献复习,对miR-34c-5p调控TP53、CCND1、Bcl2、CDK6和MET表达的过程进行探讨,从而构建出以miR-34c-5p为中心,通过调节TP53、 CCND1、CDK6、Bcl2和MET的表达量,利用PI3K/AKT/mTOR信号通路调节鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移的作用网络。结论1.鼻咽癌组织与鼻咽非癌对照组织间的niRNA差异表达谱,包括4个上调miRNA ( miR-205-5p、miR-92a-3p、miR- 193b-3p、miR-27a-5p )和4个下调miRNA (miR-34c-5p、miR-375、miR-92b-3p和miR-449c-5p)。2.鼻咽癌组织qPCR验证确认了miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p和]aaiR-27a-5p表达上调,以及miR-34c-5p、miR-375、miR-449c-5p的表达下调。miR-34c-5p的表达量与鼻咽癌临床分期和T分期呈负相关。3.GO分析提示预测的靶基因功能集中于与癌细胞密切相关的细胞修复、运动及分泌功能,KEGG通路分析则提示自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路可能是miR-34c和miR-449c在鼻咽癌调控肿瘤免疫中的作用途径。4.IPA分析得到以miR-34c-5p为中心的调控网络,通过调节TP53、MET、 CCND1、CDK6、Bcl2表达水平并由PI3K/AKT/mTOR通路作用于鼻咽癌细胞周期,影响癌细胞的生长、增殖、侵袭及转移,为制定分子靶向治疗、减少复发转移提供分子理论基础。