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猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的以严重的肠炎、呕吐和水样腹泻为特征的猪的一种急性肠道传染病，是危害我国养猪业主要疫病之一。1976年我国首次报道此病，2011年全国范围内再次爆发仔猪腹泻疫情，新生仔猪的发病率和死亡率极高，为了探究此次仔猪腹泻疫情的病因，了解病原的分子流行病学特点，主要开展了以下研究：在仔猪腹泻疫情流行期间，我们从浙江、福建等5个省、市不同地区的发病猪场采集了115份临床腹泻样品，通过RT-PCR方法检测结果显示PEDV阳性率高达81.7%，我们选取了部分阳性样品进行PEDV全长基因组和S、M、N、ORF3基因的克隆和测序，并进行序列比对和遗传演化分析。全长基因核苷酸序列比对结果显示，流行毒株ZJCZ4与参考株CHGD-01的同源性较高，达到99.1%，与经典代表株CV777的同源性为96.9%。主要结构蛋白氨基酸序列比对结果表明：流行毒株的S蛋白氨基酸发生变异较为明显，变异位点主要集中在S1区域。与参考株CV777相比，流行毒株的S1中存在5个氨基酸插入（59QGVN62and140N）和2个氨基酸缺失（161GK162或163NI164），其中2个中和抗原表位(499-638aa与764-771aa)存在8个氨基酸突变，6个潜在N糖基化位点发生突变。M和N蛋白的氨基酸序列较保守，同源性分别在96.5%~100%和95.3%~98.1%之间。系统进化树分析结果显示本研究获得的PEDV流行毒株与中国近期分离株CHGD-01和CH/FJND-3/2011等共处于同一分支，与2007年后韩国分离株Chinju99等亲缘关系较近。对ORF3基因核苷酸序列比较结果显示，2个流行毒株HEB-1和SD-5的ORF3基因在245nt~293nt存在49个核苷酸缺失，与弱毒疫苗株DR13的亲缘关系较近，推测其为PEDV弱毒株。根据PEDV弱毒与强毒ORF3基因存在基因缺失差异的特点，本研究在ORF3基因缺失区两端的保守区域设计1对特异性引物，对反应体系、Tm值等反应条件优化，结果表明建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因，其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300bp，而弱毒疫苗株则为250bp左右；该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增，检测病毒的敏感性为100TCID50/0.1mL。对仔猪腹泻临床样品检测结果显示，PEDV自然感染的阳性率为65.4%。本研究建立的RT-PCR鉴别诊断方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，为PEDV疫情诊断和流行病学监测提供了有效方法。序列分析显示流行毒株N蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原，本研究利用原核表达系统融合表达PEDVN蛋白，分子量约为81kDa。WesternBlot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。以纯化的N蛋白为包被抗原，对一系列反应条件优化后，初步建立了抗体检测间接ELISA方法，该方法与其他猪源病毒感染的阳性猪血清无交叉反应。对20份已知PEDV阳性和阴性猪血清进行ELISA检测，其结果与RT-PCR抗原检测结果的符合率为85%，表明本研究融合表达的N蛋白具有较好的抗原性，可以作为诊断抗原用于特异性检测PEDV感染或免疫猪血清抗体。为了进一步研究N蛋白的抗原性，我们将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术筛选获得了5株能稳定分泌抗PEDVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各株单抗腹水的ELISA效价均在105以上。经IFA试验证实，5株单抗都可以特异性识别PEDV感染的细胞，同时，利用单抗N-1作为检测抗体，对临床样品中的PEDV抗原进行双抗体夹心ELISA检测应用，结果显示单抗N-1可以特异性识别临床样品中的PEDV，其检测的灵敏度为100TCID50，且与其他猪源病毒无交叉反应，表明本研究获得的N蛋白单抗特异性较强、敏感性较高，可以作为检测PED抗原的有力工具。