猪圆环病毒(Porcine Circovirus, PCV)为圆环病毒科,圆环病毒属成员。根据致病性、抗原性及核苷酸序列不同可将猪圆环病毒分为两个型：猪圆环病毒1型(PCV1)与猪圆环病毒2型(PCV2)。一般认为PCV1没有致病性,而PCV2则可以引起断奶仔猪多系统衰竭症(PMWS)、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎,猪皮炎和肾病综合征(PDNS)以及猪的先天性震颤(CT)等疾病。该病毒在全球各地广泛流行,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。目前,猪圆环病毒病(PCVD)尚无有效的治疗方法,主要是以疫苗预防为主。由于PCV2在细胞上增殖滴度低、体外培养困难,而且病毒复制机理尚不清楚,这给PCVD的防治带来了很大的障碍。本研究共构建了四个含有EGFP或Rluc报告基因的PCV2复制子及三个非复制子对照。经实验验证,本研究构建的基于Rluc报告基因的PCV2复制子具有较好的活性。该复制子既可为体外进一步研究PCV复制机制奠定基础,又可为抗病毒先导化合物的筛选提供新方法。本研究的主要内容和结果如下：(1)基于EGFP、Rluc报告基因标记的PCV2复制子的构建通过PCR方法,从含有PCV2全基因组的质粒pT-PCV2上扩增ORFl基因片段,然后将其插入到pIRES2-EGFP或pc-Rluc中,得到质粒pIRES2-ORF1-EGFP和pc-Rluc-2A-ORF1。用带有PCV2复制起始区(Ori)的引物,扩增上述质粒中CMV-polyA片段,并连接至pMD18-T上,构建了PCV2复制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP、pT-Ori-Rluc-2A-ORF1质粒。同时,构建了不带Ori的非复制子对照pT-ORF1-IRES-EGFP和pT-Rluc-2A-ORF1。(2)PCV2复制子的优化将构建好的复制子转染293T细胞后,观察报告基因的表达情况。结果发现复制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP与其非复制子pT-ORF1-IRES-EGFP的EGFP表达水平相当,复制活性较弱；复制子pT-Ori-Rluc-2A-ORF1与非复制子pT-Rluc-2A-ORF1的Rluc表达水平远远低于pcDNA3.1(+)上直接表达Rluc,因此也不是理想的PCV2复制子。故对复制子进行了优化,将Ori插入到质粒pc-Rluc-2A-ORF1中,得到了复制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori。将优化的复制子转染293T细胞,发现复制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的Rluc表达水平显著高于非复制子对照pc-Rluc-2A-ORF1,且pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的Rluc表达水平更高。将一定剂量复制子质粒转染293T细胞,48h收取细胞样品并提取细胞内的总DNA,然后用特异性引物进行荧光定量PCR以检测质粒的拷贝数,结果表明,复制子质粒的拷贝数显著高于非复制子的拷贝数,且pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的拷贝数最高,是比较理想的PCV2复制子。(3)PCV2复制子活性检测条件的优化为了确定最佳收样时间和最佳转染剂量,首先转染一定量的质粒到293T细胞中分别于36h、42h、48h收取细胞样品进行海肾荧光素酶活性检测,结果显示随着转染时间的增加,荧光值也随之增加,48h的荧光值最高,各时间点内复制子与非复制子对照的荧光值都呈显著差异,综合分析最终确定转染后48h为最佳收样时间。然后转染不同剂量的质粒(1011、1010、109个拷贝数)到293T细胞中,于48h收取细胞样品进行海肾荧光素酶活性检测,结果显示转染同一剂量的复制子与非复制子的荧光值呈显著差异。由于转染1011个拷贝数质粒的荧光值最高值为2.1×107,而再增加转染质粒剂量,该值也不会增加；而转染109个拷贝数质粒的荧光值波动较大,易受其他条件影响,最终确定1010个拷贝数为最佳转染剂量。(4)基于PCV2复制子药物筛选方法的建立用已优化好的条件,将复制子转染293T细胞,4h后加入终浓度为100μM的利巴韦林。然后于48h收取细胞样品进行海肾荧光素酶活性检测。加入利巴韦林试验组与未加利巴韦林试验组相比较,复制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的荧光值分别降低27.9%和16.7%,而非复制子质粒的荧光值无显著差异。将一定剂量质粒转染293T细胞,4h后加入终浓度为100μM的利巴韦林。于48h收取细胞样品并提取细胞内的总DNA,然后用特异性引物进行荧光定量PCR以检测质粒的拷贝数。结果表明与未加入利巴韦林试验组相比,加入利巴韦林试验组中复制子pc-Ori-Rluc-2A-ORF1的拷贝数减少了80.6%,复制子pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的拷贝数减少了51.4%,而非复制子质粒的拷贝数无显著差异。