甲氧基聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺纳米复合物介导的CXCL10基因治疗联合放疗抗子宫颈癌作用的体外实验研究

来源 :四川医科大学 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tianzhizui
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目的:近年来,子宫颈癌的发病呈现年轻化趋势,而放疗在其治疗中占据了举足轻重的地位,但肿瘤的乏氧状态等导致子宫颈癌细胞产生放疗抵抗,放疗疗效亟待改善。数十年来,基因治疗掀起热潮,而研究证实CXC趋化因子配体10(CXCL10)具有诱导凋亡、抑制血管生成、抗HPV病毒等多种抗子宫颈癌作用,甚至可起到放疗增敏的作用。非病毒载体如纳米材料作为理想的基因载体,可以有效地将治疗基因被动靶向于肿瘤细胞。因此设想采用一种纳米材料载体负载CXCL10与放疗联合,分别在体内和体外探究其提高放疗疗效的作用,从而为形成结合放疗和基因治疗的子宫颈癌综合治疗新方法指明方向。  方法:本实验采用低分子量PEI(1200Da)与mPEG-PCL(5000-2000Da)组装成高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI。并采用Varian400型核磁共振仪和傅里叶红外光谱仪对聚合物前体mPEG-PCL及该高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI的结构进行表征,通过激光粒度仪和透射电子显微镜分别测定mPEG-PCL-g-PEI及CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI纳米粒子的粒径、电位与形貌。利用带正电荷的纳米粒和带负电荷的质粒之间的静电引力,制备了绿色荧光蛋白质粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI,通过琼脂糖凝胶电泳实验探寻出纳米粒负载质粒DNA的最佳转染比例,再在倒置荧光显微镜下观察其转染绿色荧光蛋白质粒后表达绿色荧光蛋白的情况,接下来,用该纳米粒负载CXCL10质粒,采用PCR法扩增CXCL10目的基因片段,电泳验证转染的成功。利用MTT法测定CXCL10/mPEG-PCL-g-PEI纳米复合物转染的细胞放疗后的相对细胞活性。  结果:傅里叶变换红外光谱、1H-核磁共振光谱对mPEG-PCL前体聚合物及聚合物mPEG-PCL-g-PEI的结构表征证明该两亲性嵌段聚合物成功合成,具有良好的水溶性,且能够在水溶液中自组装成为纳米胶束结构。琼脂糖凝胶电泳表明纳米粒负载质粒DNA的最佳转染比例为:48/1(w/w)。mPEG-PCL-g-PEI及CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI纳米粒子(w/w:48/1)的透射电镜图表明两种纳米复合物均为球形。平均粒径分别是20nm和46nm,电位分别为+21.76、+5.71mV。细胞毒性试验表明,在低浓度范围内,该纳米材料细胞毒性较小,具有生物相容性,随着聚合物浓度的增加,细胞毒性越大(p<0.05)。最佳转染质量比(w/w:48/1)下载绿色荧光蛋白质粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI对Hela细胞进行转染,荧光显微镜成像证实其转染效率稍低于高分子量PEI25kD,但细胞毒性较小。PCR扩增目标片段CXCL10基因片段所在的强电泳条带证实载CXCL10质粒转染成功。MTT法初步证实CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI纳米复合物转染Hela细胞后成功表达,并在3Gy、6Gy、9Gy的相对细胞活性小于单纯材料组和载空质粒材料组。  结论:mPEG-PCL-g-PEI被成功合成,在低浓度范围内,细胞毒性较小,高浓度范围细胞毒性与浓度呈正相关,且能自组装成纳米胶束,该纳米胶束表面的正电性使其能够成功缩合功能基因如EGFP质粒和CXCL10质粒,分别在Hela细胞中表达绿色荧光蛋白和CXCL10细胞因子。初步证实成功表达了CXCL10的Hela细胞对放疗敏感性较未表达CXCL10的Hela细胞高。
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