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目的:研究红景天苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经细胞定向分化的过程中,Ca2+信号相关蛋白及基因的表达情况,探讨红景天苷诱导BMSCs向神经细胞定向分化的作用及分子机制,为BMSCs用于神经系统疾病的治疗提供新的思路和方法,为中医“肾生髓”理论提供分子生物学实验依据。方法:培养小鼠BMSCs系D1细胞至80%融合,将细胞分为对照组和红景天苷诱导组,对照组采用D/F12完全培养液培养细胞,诱导组使用100mg·L-1红景天苷分别作用细胞12,24,48和72h:①MTT法检测D1细胞诱导前后的增殖率;②免疫荧光染色法标记细胞骨架蛋白β-Tubulin,观察细胞的形态变化;③荧光免疫细胞化学染色法检测诱导前后各组细胞神经元标志分子神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)、微管相关蛋白2(Microtubule associated protein 2,MAP2)和β-TubulinⅢ(β-微管蛋白Ⅲ)的表达。将D1细胞分为对照组和诱导组,诱导1组使用不同浓度红景天苷(5,10,20,50和100 mg·L-1)分别诱导细胞24h,诱导2组使用100mg·L-1红景天苷分别诱导D1细胞12,24,48和72h:①Western blot方法检测诱导前后MAP2蛋白的表达情况;②使用Ca2+染色剂Fluo-3/AM负载细胞,观察细胞内Ca2+荧光强度的变化;③Western blot方法检测Ca2+/Ca M信号通路中关键分子钙调蛋白(Calmodulin,Ca M)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ)蛋白表达水平。使用Ca2+信号特异性阻断剂:乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸[(Ethylene Glycol-bis-(β-Aminoethyl)–N,N,N,N-Tetraacetic Acid,EGTA]、硝苯地平(Nifedipine)和PI3K抑制剂(LY294002),按不同方法作用D1细胞24h,采用Western blot方法检测不同阻断剂作用细胞前后Ca M和NSE蛋白的表达。红景天苷分别作用D1细胞12,24和48h后,运用PCR-array技术检测诱导前后c AMP/Ca2+信号通路中84个Ca2+相关基因m RNA的表达,从中筛选出表达差异较显著的基因进行分析,运用Western blot方法对其中上调基因Ptgs-2的蛋白表达进行检测。结果:(1)细胞形态学染色结果显示:空白对照组细胞呈多角形或纺锤形,红景天苷诱导D1细胞24h时,可见部分细胞伸出突起,胞体变大;诱导48h时细胞具有典型的神经细胞样特征,突起细长、胞体变小,部分细胞突起连接成类似神经网络的网状结构。(2)MTT实验结果显示:红景天苷诱导D1细胞12、24、48和72h后,与空白对照组比较,48、72 h诱导组细胞增殖活性降低,差异具有统计学意义(P<0.05),说明红景天苷诱导后期可抑制D1细胞增殖而促进其分化。(3)荧光免疫细胞化学染色结果显示:红景天苷诱导D1细胞12、24、48和72h后,与空白对照组比较,红景天苷诱导组NSE、MAP2和β-TubulinⅢ蛋白阳性率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。(4)激光共聚焦显微镜检测结果显示:不同浓度红景天苷诱导BMSCs后,Ca2+荧光强度变化不同,100mg·L-1红景天苷诱导组与空白对照组BMSCs和其它各诱导组比较显著增强,差异有统计学意义(P<0.01);同一浓度红景天苷诱导BMSCs不同时间后,48h诱导组Ca2+荧光强度较高,与其它各诱导组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。(5)Western blot实验结果显示:与空白对照组比较,随着红景天苷诱导剂量的增加MAP2蛋白表达量逐渐上调,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),同一质量浓度红景天苷诱导D1细胞24、48h时与空白对照组比较MAP2蛋白表达量显著升高,说明红景天苷可诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,且诱导具有剂量和时间效应。不同质量浓度红景天苷作用D1细胞24 h,与空白对照组比较,诱导组细胞Ca M蛋白表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与空白对照组比较5、10、20mg·L-1诱导组Ca MKⅡ表达水平均上调,差异具具有统计学意义(P<0.01),100mg·L-1诱导组Ca MKⅡ表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。100 mg·L-1红景天苷作用D1细胞12,24,48和72h,与空白对照组比较,Ca M的表达有差异,且差异均具有统计学意义(P<0.01),12,24 h组表达上调,48,72 h组表达下调;Ca MKⅡ蛋白表达与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),其中48 h组表达上调,异均具有统计学意义(P<0.01),其余各时间点表达均下调,异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(6)阻断剂组Western blot实验结果:Ca2+阻断剂作用后,与空白对照组比较,红景天苷诱导组和各阻断剂组Ca M蛋白表达均显著下调,差异具有统计学意义(P<0.01);与红景天苷诱导组相比,Ca M蛋白表达在LY294002加红景天苷诱导组显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01),其余各阻断剂组均显著下调,差异具有统计学意义(P<0.01)。NSE蛋白表达与空白对照组相比,红景天苷诱导组和各阻断剂组均显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05);与红景天苷诱导组相比,LY294002加红景天苷诱导组、三种阻断剂加红景天苷诱导组、EGTA诱导组的NSE蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01),EGTA加红景天苷诱导组、LY294002诱导组、三种阻断剂共同作用组表达下调,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。(7)PCR-Array检测结果:红景天苷分别诱导D1细胞24、48和72h后,与空白对照组比较,表达有差异的基因共有38个,其中上调基因23个,下调基因15个,以5倍为差异显著标准,经过筛选上调较显著的基因有:DNA损伤诱导转录因子3(DNA damage-inducible transcript 3,DDIT3)、热休克蛋白5(Heat shock proteins,HSPA5)、磷酸酶1调节亚单位15a(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 15a,Ppp1r15a)、前列腺素内过氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs-2);下调较显著基因有:胰高血糖素(Glucagon,Gcg),白细胞介素-2(Interleukin-2,Il-2),肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF),生长激素抑制素(Somatostatin,Sst)。(8)Western blot结果显示:与对照组比较,STAT3蛋白表达在24、48h时降低,72h时升高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。Ptgs-2的表达在72h时升高,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)红景天苷能诱导D1细胞分化为神经元细胞。(2)在诱导D1细胞向神经元细胞定向分化的过程中红景天苷可能与L-型钙通道阻断剂作用类似,Ca2+/Ca M信号通路在诱导分化过程可能起负调控作用。(3)红景天苷诱导D1细胞向神经元细胞的分化可能与c AMP/Ca2+信号通路中DDIT3、HSPA5、Ppp1r15a、Ptgs-2的上调,Gcg、Il-2、TNF、Sst的下调有关。