论文部分内容阅读
本研究对一个三代均有脂蛋白。肾病患者的完整家系进行研究,希望找到中国脂蛋白肾病患者的apoE基因变异,并对此变异基因进行功能研究,进一步阐明apoE基因变异在脂蛋白肾病发病机制中的作用。
第一部分脂蛋白肾病相关新的载脂蛋白E基因突变的鉴定。通过分析包含4个脂蛋白肾病患者的一个家系所有成员的载脂蛋白E(apoE)基因,寻找脂蛋白肾病相关的载脂蛋白E突变位点。询问全部家系成员的病史,并进行尿常规、血肌酐、血脂、血清脂蛋白检查,抽提基因组DNA,PCR法扩增所有成员的apoE第4外显子,纯化的PCR产物直接测序,并将经纯化后的PCR产物亚克隆至pMD 18-T载体,挑菌落测序。4例脂蛋白肾病患者和一位无症状直系亲属均为携带一种新的apoE点突变的杂合子,150号密码子发生点突变:CGC—>CCC(由精氨酸变成脯氨酸),均伴有apoE的升高。 apoE点突变apoE Guangzhou(arg150 pro)可能与该家系脂蛋白肾病的发病密切相关。
第二部分重组apoE Guangzhou突变基因腺病毒载体的构建。利用AdEasy腺病毒载体系统构建重组apoE Wild、apoE Guangzhou和apoE sendai腺病毒载体,为进一步研究apoE Guangzhou功能奠定工作基础。从脂蛋白肾病患者及正常人外周血白细胞提取的总RNA中通过PCR的方法扩增出目的基因apoE GLlangzhou和apoE Wild,连接到pMD18-T vector上得到apoEGuangzhou in pMD18-T vector和apoE Wild in pMDl8-T vector质粒。以apoE Wildin pMD18-T vector质粒为模板,通过重叠延伸PCR定点诱变法构建apoE sendaipMD18-T vector质粒。双酶切后连于padtrack-CMV中,得到的穿梭质粒pAdTrack-apoE Wild、pAdTrack-apoE Guangzhou和pAdTrack-apoE Sendai经酶切线性化后和腺病毒骨架质粒AdEasyl一起采用电穿孔转化到BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中同源重组,利用其卡那霉素抗性挑选同源重组质粒,用限制性内切酶Pac Ⅰ进行酶切鉴定。经质粒测序证明成功将目的基因apoe Wild、apoE GLlangzhou和apoE sendai装载在载体上,重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-apoE wild,pAdEasy-GFP-apoE Guangzhou andpAdEasy-GFP-apoE Sendai)经限制性内切酶检测得到正确片段。提示成功地构建了携带apoE Wild、apoe Guangzhou和apoE sendai基因的重组腺病毒载体。