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[目的]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)是当今全球范围内医院感染的重要病原菌之一,它对常用的包括甲氧西林在内的多种抗菌药物均广泛耐药。目前可供临床治疗MRSA的药物较少,常用的药物有糖肽类抗生素,如万古霉素及新研发的抗生素如利奈唑胺和达托霉素,其它抗生素的效果均不佳。因此,研制新的抗MRSA药物尤为迫切。研究表明,传统的中草药治疗MRSA具有一定优势。本课题组前期工作已证实:从广西藤茶中提取的黄酮类成分——双氢杨梅树皮素(APS)对MRSA、MSSA等临床常见致病菌在体外、半体内均表现出极高的抗菌活性;对标准SA和MRSA腹腔感染的小鼠有一定的保护作用。电镜观察发现APS使细菌的细胞壁、细胞膜受到不同程度的损害,细菌形态发生改变,并能明显抑制细菌TdR、UR的生物合成。为此,本课题拟采用体内外抗菌实验,深入研究APS单用及APS与β-内酰胺类抗生素联合应用对MRSA的作用及其可能的作用机制,为寻找有效的治疗MRSA的药物提供理论依据。[方法]一、体外抗菌实验:对从临床收集、分离的15株菌株采用K-B纸片扩散法及mecA基因检测法进行MRSA菌株的鉴定;采用肉汤二倍稀释法测定APS对四株 MRSA (MRSA-6、MRSA-8、MRSA-9、MRSA-12)和标准敏感金葡菌的 MIC;采用棋盘法测定APS与β-内酰胺类抗生素联合应用对MRSA -6菌株的FICI。二、体内抗菌实验:腹腔注射MRSA-6建立小鼠MRSA腹腔感染模型,滴鼻吸入MRSA-6菌液建立小鼠肺部感染模型,观察APS单用及与β-内酰胺类抗生素合用对小鼠MRSA体内感染的保护作用。三、细菌超微形态学研究:不同浓度APS及β-内酰胺类抗生素单用或合用作用于MSSA和MRSA后,分离收集菌体,采用扫描电镜、透射电镜观察对药物对细菌形态超微结构的影响。四、对β-内酰胺酶活性影响的研究:通过反复冻融、酶水解,结合超声粉碎的方法,提取出MRSA的β-内酰胺酶粗提液,采用头孢硝噻吩水解法观察药物对β-内酰胺酶活性的影响。五、对MRSA PBP2a蛋白表达的影响:将不同浓度APS单用及与泰能、头孢西丁合用作用于MRSA后,超声粉碎MRSA细菌膜蛋白,行SDS-PAGE,用分光光度扫描仪测定PBP2a的相对含量,观察药物对MRSA PBP2a表达的影响。六、对耐药基因rmecA、femA、femB的mRNA表达的影响:将不同浓度APS单用及与泰能、头孢西丁合用作用于MRSA后,收集菌体,采用柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒提取细菌总RNA,合成cDNA,PCR扩增目标基因,琼脂糖凝胶电泳半定量分析mecA、femA、femB的表达。七、对耐药基因blaZ的mNRA表达的影响:将不同浓度APS单用及与泰能、头孢西丁合用作用于MRSA后,收集菌体,采用柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒提取细菌总RNA,合成cDNA, PCR扩增目标基因,琼脂糖凝胶电泳半定量分析blaZ的表达。[结果]一、经K-B纸片扩散法及mecA基因检测法鉴定,有4株菌株为符合要求的MRSA。肉汤二倍稀释法测得单用APS的MIC为125μg/mL。联合药敏实验结果显示,在与6种β-内酰胺类抗生素联合用药中,除与头孢吡肟合用表现为相加作用外,其余5种抗生素——青霉素、苯唑西林、头孢唑林、泰能、头孢西丁与APS合用均表现为协同抗菌作用。二、体内抗菌实验中,APS与泰能或头孢西丁合用对腹腔MRSA感染小鼠的保护作用明显好于各个药物单用的效果;其中APS与泰能联合应用对MRSA腹腔感染小鼠的保护作用最强,表现出较强的协同作用;APS与头孢西丁合用后虽然对感染小鼠的保护率与单用APS相当,但比单用头孢西丁的ED50下降将近16.7倍。APS单用能显著减少肺部MRSA感染小鼠的肺部活菌数;高剂量的APS与泰能、头孢西丁合用后,其肺部活菌计数明显少于模型组。APS与泰能或头孢西丁合用能明显改善肺部炎症病理状态。三、在扫描/透射电镜下,经APS单用或与β-内酰胺类抗生素作用后的MRSA绝大多数菌体的细胞壁、细胞膜结构层次不清晰,胞壁出现溶解破损现象,细胞膜皱缩变形或破裂,菌体细胞明显膨大,可见内容物溢出等现象。四、头孢硝噻吩水解法结果表明,他唑巴坦对β-内酰胺酶具有强的抑制作用。APS无论单用或与泰能、头孢西丁合用对β-内酰胺酶的抑制作用都较弱,与空白未用药组比较,无显著性差异。五、分光光度法结果表明单用APS和泰能能显著减少PBP2a含量,单用头孢西丁对MRSA PBP2a的表达无显著作用。而APS与两药联合应用时,对MRSA的PBP2a表达具有明显抑制作用。六、PCR结果表明,APS与泰能、头孢西丁合用后,能明显减少mecA、femA、femB基因的mRNA的表达;而不论APS单用或与泰能、头孢西丁联合用药后对blaZ的mRNA的表达无明显影响。[结论]APS与β-内酰胺类抗生素合用体内外均具有协同抗菌作用。通过破坏细菌细胞壁,减少PBP2a的表达,阻断mecR1-mecI-mecA信号通路中的mecA及耐药辅助基因femA、femB的mRNA表达,从而降低MRSA的耐药性,这可能是APS与β -内酰胺类抗生素合用逆转MRSA耐药性的作用机制。