[研究背景和目的]胃癌是世界上死亡率较高的疾病,且发现的时候大多数是进展期,早期胃癌的5年生存率在70-75%左右[2],但进展期的5年生存率只有35%。提高生存率是我们的主要治疗目标。化疗是当前治疗胃癌的主要手段之一[3],尽管新的抗癌药物及化疗方案不断推出,但治疗效果仍无明显进展,其主要原因就是胃癌细胞对化疗药物产生了多药耐药,从而使化疗药物的应用受到明显的限制。低氧环境是多种实体肿瘤包括胃癌的特征之一,低氧下发生化疗抵抗是肿瘤化疗失败的重要原因,多种化疗药物低氧下抗肿瘤作用减弱[4]。由于肿瘤的低氧微环境、肿瘤干细胞的存在等多种原因发生放化疗抵抗、多药耐药,最终导致治疗失败。5-Fu是一种抗代谢的化疗药物,是国内外肿瘤临床辅助化疗和新辅助化疗最常选用的药物之一,它能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,从而阻断脱氧尿苷酸转变为脱氧胸苷酸,影响细胞DNA的合成导致细胞损伤和死亡。临床试验表明包含5-Fu的化疗方案能提高胃癌患者的生存率,但仍存在局部治疗的失败和远处转移。有研究结果表明,患者癌细胞内低氧环境导致了耐药性存在,降低了的5-Fu的疗效。近年的研究认为,肿瘤组织中存在的肿瘤干细胞,是肿瘤产生、转移、复发、耐药及放化疗抵抗的主要原因。研究肿瘤干细胞可以帮助我们更好的了解肿瘤的生物学特性和改善肿瘤的化疗抵抗。但至目前,尚无法直接分离鉴定其中的干细胞,我们只能选择跟肿瘤干细胞关系密切的某些标志物来研究。塞来昔布是非甾体类抗炎药的一种,是选择性的环氧化酶2抑制剂,有抗炎、镇痛作用,根据国内外临床及实验研究表明,塞来昔布还具有抑制肿瘤的作用,但非甾体类抗炎药抗肿瘤的确切机制尚不清楚[12-14]。鉴于以上的研究结果,我们拟通过观察5-Fu、塞来昔布以及它们的联合用药对体外生长的人胃癌细胞及对裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用,以及与肿瘤干细胞标记物HIF-2α、ABCG2、OCT-4表达的关系,探讨5-Fu与塞来昔布联合应用是否能通过降低人胃癌细胞及裸鼠人胃癌移植瘤的干细胞标记物HIF-2α、ABCG2、 OCT-4的表达,从而改善和逆转5-Fu的化疗抵抗。[方法]1.体外实验：将人胃癌细胞株SGC7901接种于RPMI1640培养液中,常规传代培养。化学缺氧剂CoCl2(浓度为150μmol/L)用于模拟肿瘤内低氧微环境。取对数生长期的SGC7901细胞以2×105/ml的密度接种于96孔培养板,每孔体积为200μ1。实验分4组：低氧对照组、5-Fu组、塞来昔布组、联合组。MTT法测定低氧下不同浓度的5-Fu、塞来昔布及联合组分别对胃癌细胞的增殖抑制率,免疫细胞化学法、RT-PCR、Western-blot法观察各组SGC7901细胞HIF-2α、 ABCG2、OCT-4的蛋白和mRNA的表达。2.体内实验：选用5-6周龄雄性裸鼠共28只,体重18-22g,取对数生长期的SGC7901人胃癌细胞悬液,无菌条件下将细胞悬液接种于裸鼠右腋皮下,继续饲养2周,建立裸鼠荷瘤模型。并将裸鼠分为4组：空白对照组、5-Fu组、塞来昔布组、联合组。末次给药后次日,处死动物,剖取瘤体组织,电子天平称重瘤块,计算各组抑瘤率,测量肿瘤的长短径,计算肿瘤体积。免疫组织化学法、RT-PCR、 Western-blot法观察各组HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白和]mRNA的表达。[结果]1.5-Fu联合塞来昔布对体外SGC7901细胞的抑制作用：低氧环境下,不同浓度的5-Fu和塞来昔布呈剂量依赖性的抑制SGC7901细胞增殖,接种后的细胞在48小时处于对数生长期,经公式计算出5-Fu和塞来昔布对SGC7901细胞的半数抑制浓度(IC50)分别约为200mg/L、100 μmol/L。低氧下半数抑制浓度的5-Fu、塞来昔布和联合组作用于SGC7901细胞48小时后,其生长抑制率分别为52.61%、46.1%、66.09%,低氧下5-Fu、塞来昔布和联合组都能抑制SGC7901细胞的增殖,但以联合组抑制率最高,联合组与其它组比较,差异有统计学意义(F=35.237,P<0.05)。低氧对照组HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈较高水平表达,5-Fu组加入半数抑制浓度的5-Fu作用48小时,HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表达进一步增加,但在塞来昔布组和联合组均呈较低水平表达,5-Fu组、塞来昔布组、联合组与低氧对照组两两比较,差异均具有统计学意义(mRNA: HIF-2αF=819.242, ABCG2 F=515.693, OCT-4 F= 1929.264, P<0.01。蛋白：HIF-2αF=4788.138, ABCG2 F=1739.794, OCT-4 F= 25656.397, P<0.01)。2.5-Fu联合塞来昔布对裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用：5-Fu、塞来昔布和联合组均能抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长,但5-Fu组的平均瘤重及体积与对照组比较,差别无统计学意义(P>0.05),塞来昔布组和联合用药组瘤块的平均瘤重及体积显著小空白对照组(P<0.05),且联合用药组显著小于5-Fu组和塞来昔布组(P<0.05),抑瘤率分别为26.36%、59.70%、88.37%,以联合组抑瘤率最高,联合组与5-Fu组、塞来昔布与5-Fu组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈较高水平表达,5-Fu组HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表达进一步增加,但在塞来昔布组和联合组均呈较低水平表达,5-Fu组、塞来昔布组、联合组与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。[结论]1.塞来昔布对低氧环境下体外生长的人胃癌SGC7901细胞和体内生长的裸鼠人胃癌移植瘤均具有抑制作用,其机制可能与通过减少肿瘤细胞和肿瘤组织中干细胞标记物HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表达有关。2.5-Fu与塞来昔布在体内、体外联合应用均有协同抗肿瘤作用,其机制可能是通过减少胃癌SGC7901细胞和裸鼠人胃癌移植瘤肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、 OCT-4 mRNA及蛋白等肿瘤干细胞标记物的表达,改善或逆转胃癌的化疗抵抗,从而增强化疗效果。