研究背景和目的:烧伤是由物理和化学因素作用于体表所造成的皮肤、皮下以及深层组织的损伤,是日常生活、战争中常见的外伤性疾病。感染、休克和多脏器功能衰竭是烧伤的三大并发症,其中感染致死的比率最高。根据世界卫生组织的最新报告,每年约有265000人死于烧伤。有效地预防伤口感染和改善患者愈合效率对烧伤感染的治疗至关重要,烧伤创面临床常见的治疗方法是皮肤移植联合抗生素治疗。近年来,抗生素的过度使用导致细菌多药耐药性（Multidrug resistance-MDR）的出现,这些菌株通常会形成特殊的生物膜,用以保护细菌免受抗菌药物和吞噬作用的侵害。因此,探索新的治疗策略控制和克服多药耐药细菌是目前烧伤外科临床抗感染亟待解决的重大课题。本论文在烧伤感染治疗中采用的光动力抗微生物化学疗法（Photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT）是一种新型微创策略,光敏剂（Photosensitizer,PS）通过光化学反应产生活性氧（ROS）,导致创伤部位细菌不可逆的损伤和死亡。华卟啉钠（DVDMS）是我国具有自主知识产权的光敏剂,本课题在前期的研究中发现DVDMS在具有很好地声光活性的同时,还兼有良好地水溶性、较低地暗毒性与较高地单线态氧产率等优势,预示着DVDMS将在PACT中有较大的发挥空间。PACT的应用优势是在合适的外用药物制剂中采用特定的结合方式加入一定剂量的PS,然后利用光动力激活PS获得光化学抑菌效果。外用药物制剂有液体、半固体和固体,根据结构基质的不同,可分为乳剂、凝胶剂、脂质体和透皮贴剂。与常规药物载体相比,基于水凝胶的药物递送系统在PACT中具有显著地优势。首先,水凝胶基质通常由剂型不同的化合物组成,使其适合封装各种分子（光敏剂和其他功能性药物）和纳米制剂。其次,水凝胶基质流动性低,可以使PS长时间地停留在原位增加药物渗透作用,减少PACT的副作用。伤口愈合是一个复杂的生物学过程,涉及一系列动态事件,包括止血、炎症、细胞增殖和分化、新血管及肉芽组织形成、胶原蛋白合成、皮肤上皮化和伤口收缩等。大量研究证实碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）是动物和人类组织修复、血管生成中重要的生物大分子。在PACT治疗中引入外源性的生长因子可以在杀菌后刺激胶原蛋白的合成并减轻伤口愈合中瘢痕的形成。为了避免生长因子在水溶液或较高温度下变性,利用可生物降解的聚乳酸-乙酸共聚物（PLGA）,制备PLGA-bFGF纳米颗粒,以延长bFGF的持续释放时间和生物学活性。基于PACT研究相关的创新设想,本课题进行了 DVDMS介导PACT（DVDMS-PACT）对临床常见的传染性病原体金黄色葡萄球菌及其多药耐药株(Staphylococcus aureus/Multidrug resistance-Staphylococcus aureus,S,aureus/MDR-S aureus的体外抑菌的浓度筛选与损伤机制的探究;以小鼠深二度烧伤感染模型为研究对象,评估DVDMS-PACT对烧伤感染的治疗效果;构建共载DVDMS与PLGA-bFGF纳米颗粒的智能响应性水凝胶系统（CSDP水凝胶）,并对制备的CSDP水凝胶进行表征;通过毒理实验分析CSDP水凝胶介导PACT（CSDP水凝胶-PACT）处理之后对细菌细胞膜、细胞壁、生物膜的影响;通过皮肤细菌定植量、皮肤愈合情况、伤口炎症因子与生长因子的分布规律,研究CSDP水凝胶-PACT对烧伤感染的治疗优势,由此实现烧伤感染的局部可控、可重复、高效率的协同治疗新思路。主要内容涵盖以下五个部分:研究方法及结果:（1）DVDMS-PACT对S.aureus/MDR-S.aureus的体外抑菌效果与机制探究使用电子自旋共振谱仪（Electron spin-resonance spectroscopy,ESR）检测 PS光照处理之后产生的自由基类型;通过碱性裂解法及荧光显微镜检测DVDMS在细菌内的富集规律,选择在药物最大富集的时间窗口进行PACT处理;利用平板计数法统计DVDMS-PACT处理之后的活细菌数量;SYTO 9/PI染色结合荧光显微镜与流式细胞仪检测细菌细胞膜通透性的改变;扫描电子显微镜,原子力显微镜观察细菌细胞壁,生物膜的损伤;H2-DCFH-DA染色结合流式细胞仪检测DVDMS-PACT处理后胞内活性氧水平的变化;通过转录组测序技术（RNA-seq）结合Real time-PCR技术对比DVDMS-PACT亚致死剂量下MDR-S.aureus与未处理组MDR-S.aureus的全部转录本信息,初步探究DVDMS-PACT损伤MDR-S.aureus的分子机制。研究发现:DVDMS光照处理后主要的活性氧类型是单线态氧;随着孵育时间的增加,细菌中的DVDMS相对荧光强度增加,并在75 min时达到峰值;与对照组相比,单独的DVDMS对细菌没有明显的杀伤作用,而DVDMS-PACT对S.aureus/MDR-S.aureus具有明显地杀伤,且杀伤效果与光照剂量、药物剂量呈正相关,5 μM的DVDMS联合50 J/cm2光照剂量可以清除99.99%的 S.aaureus 和 MDR-S.aaureus,其中,MDR-S.aureus的杀伤效率低于S.aureus;DVDMS-PACT处理之后细菌细胞膜、细胞壁和生物膜出现明显地破坏,并且在该过程中伴随大量活性氧的产生;RNA-seq结果分析共获得222个差异表达基因,其中111个基因表达上调,111个基因表达下调。在得到Real time-PCR验证的差异基因中,核糖体蛋白、肽聚糖和氨基酸合成相关途径下调,表明DVDMS-PACT可能通过影响蛋白质和细胞壁的形成来抑制细菌的增殖,这为以核糖体和细胞壁为靶点的抗生素耐药性地解决提供了新的思路。DVDMS-PACT处理后MDR-S.aureus的戊糖磷酸途径相关基因表达上调,戊糖磷酸途径通过产生NADPH增加细菌对氧化应激的耐受,表明DVDMS-PACT处理后MDR-S.aureus中氧化应激水平升高从而降低了其DVDMS-PACT杀伤效率。（2）DVDMS-PACT对烧伤感染的治疗研究通过控制不同的压力与温度建立小鼠深二度烧伤感染模型,研究DVDMS-PACT对烧伤感染处创面愈合、细菌定植与皮肤内生长因子水平的影响,评估DVDMS-PACT治疗烧伤感染的作用优势和生物安全性。研究发现:Balb/c小鼠于75℃联合500 g压力作用3 s后可形成深二度皮肤烧伤模型;与模型对照组相比,DVDMS-PACT处理后可快速地促进烧伤感染后的创面愈合,愈合速率与DVDMS浓度呈现剂量依赖效应;DVDMS-PACT治疗后小鼠皮肤组织内生长因子VEGF、bFGF、TGF-β1、Hyp含量升高,皮肤定植菌与炎症因子TNF-α、IL-6、MDA的含量降低。在DVDMS-PACT处理后,小鼠的体重与器官无明显的变化,表明该疗法具有一定的安全性。（3）共载DVDMS和PLGA-bFGF纳米颗粒的智能响应性纳米复合水凝胶（CSDP水凝胶）的构建与表征通过双重乳化法构建装载bFGF的PLGA纳米颗粒,利用扫描电镜、动态激光粒度分析仪、Zeta电位测定仪等表征纳米颗粒的基本属性;EDC/NHS一步法催化羧甲基壳聚糖（CMCS）和海藻酸钠（SA）形成羧甲基壳聚糖-海藻酸钠水凝胶（CS水凝胶）,在水凝胶形成过程中添加DVDMS与PLGA-bFGF纳米颗粒合成CSDP水凝胶,利用红外光谱、流变仪、万能拉伸机等技术表征水凝胶的基本性能,并研究了共载后的药物稳定性以及不同pH条件下的响应释药潜能;从细胞毒性、红细胞溶血现象和皮肤毒性评估CSDP水凝胶的安全性。研究发现:PLGA-bFGF呈现大小均一的球状颗粒,粒径在420 nm左右,可以促进小鼠成纤维细胞NIH-3T3的增殖与迁移,增加创伤皮肤组织内的胶原以及生长因子含量,有效地促进创伤的愈合;CSDP水凝胶包载DVDMS之后依旧保持其光谱特性,具有明显的pH响应释放能力,可在伤口处响应性地释放DVDMS;水凝胶固有的抗菌性、止血性能、力学性能、流变性能、粘附性则使其具有较好的伤口适应性;离体与载体的荧光成像结果显示,相比游离的DVDMS（Free DVDMS）,相同浓度的CSDP水凝胶具有更高的荧光强度与更长时间的稳定性;CSDP水凝胶联合光照处理之后的单线态氧产率是Free DVDMS的1.9倍;CSDP水凝胶体系对小鼠的红细胞,成纤维细胞和皮肤没有明显的毒副作用,证明CSDP水凝胶具有良好的安全性。（4）CSDP水凝胶-PACT对S.aureus/MDR-S.aureus的杀伤效应研究以S.aureus/MDR-S.aureus为模型,通过菌落形成单位（CFU）分析CSDP水凝胶-PACT对S.aureus/MDR-S.aureus的杀伤效率;利用SYTO 9/PI染色检测不同处理后细菌细胞膜通透性的改变;扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜的结构变化,结晶紫染色与CFU实验对生物膜进行定量、计数分析;H2-DCFH-DA染色结合流式细胞仪检测CSDP水凝胶-PACT处理后细菌内活性氧含量。研究发现:CSDP水凝胶-PACT可以有效地杀伤S.aureus/MDR-S.aureus,相同条件下的杀伤效果优于Free DVDMS-PACT与临床常用的抗生素药物;SYTO 9/PI染色观察到细菌细胞膜通透性的改变,并且在该过程中伴随大量ROS的产生;扫描电子显微镜与激光共聚焦显微镜观察到细菌生物膜结构的破坏,结晶紫定量与平板计数实验证实CSDP水凝胶-PACT可以有效地破坏细菌生物膜的结构、降低生物膜中活细菌数量。（5）CSDP水凝胶-PACT对烧伤感染的治疗研究以皮肤伤口愈合率、皮肤定植菌以及皮肤组织内的相关因子、切片染色为指标来评估CSDP水凝胶-PACT对小鼠深二度烧伤感染的治疗效果。研究发现:相比Free DVDMS-PACT与单独包裹DVDMS的水凝胶（CSD水凝胶）-PACT,CSDP水凝胶-PACT可以更加有效地减少皮肤中定植菌含量,促进皮肤的快速愈合。皮肤H&E切片染色与ELISA结果显示CSDP水凝胶-PACT可在较短时间内促进伤口部位的收缩,增加皮肤组织内胶原、毛囊的含量,降低皮肤组织的炎症因子含量,有利于伤口的快速安全愈合;治疗过程中小鼠的体重未见明显的改变,治疗结束后小鼠的主要脏器无明显的病理学异常。研究结论:（1）DVDMS-PACT可有效地杀伤S.aureus/MDR-S.aureus,对细菌细胞膜、细胞壁与生物膜造成损伤,并且在该过程中伴随大量ROS的产生;RNA-seq结果显示DVDMS-PACT处理之后共检测到222个差异基因,MDR-S.aureus差异表达基因主要集中在代谢过程、分子功能和细胞组件等方面,DVDMS-PACT损伤细菌的作用机制与这些基因的表达变化相关。（2）DVDMS-PACT可通过降低皮肤创面的定植菌数量、炎症因子含量,增加皮肤组织的生长因子的水平,促进烧伤感染处的皮肤愈合。（3）设计合成的CSDP水凝胶具有良好的机械性能、粘附性、止血性能、生物相容性以及维持负载药物的稳定性,可用于烧伤感染创面的环境响应性释放DVDMS和PLGA-bFGF纳米颗粒。（4）CSDP水凝胶联合PACT处理对S.aureus./MDR-Saureus浮游菌株与生物膜具有明显的杀伤效果,并且该效果优于Free DVDMS联合PACT处理组。（5）CSDP水凝胶联合光照处理组可促进烧伤感染后皮肤的快速愈合,同时降低皮肤定植菌与炎症因子含量,提高皮肤组织中生长因子的水平;共载的水凝胶联合光照处理的治疗效果优于单独包载DVDMS联合光照处理组。