在细菌疫苗研制领域,多糖疫苗一直以来占据了重要位置。然而,多糖作为T细胞非依赖型抗原,免疫原性较弱,对于小于2周岁的婴幼儿及有免疫性缺陷病的高危人群不能产生有效的免疫力。目前多糖疫苗的研究重点已经转向多糖-蛋白结合疫苗,多糖-蛋白结合疫苗能同时诱发机体非T细胞依赖和T细胞依赖的免疫反应,产生长久的免疫保护作用。然而,细菌多糖-蛋白结合疫苗是通过化学偶联方法制备,存在产物不均一和成本高等缺陷。近年来,随着生物信息学以及相关检测方法的发展,人们发现糖基化修饰系统也广泛存在于原核生物,其中,研究较为透彻的是空肠弯曲弧菌(Campylobacter jejuni)的N-糖基化修饰系统、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的O-糖基化修饰系统,目前这三套糖基化修饰系统已经功能性地转移至大肠杆菌,并且,糖基化修饰途径中的关键酶“寡糖转移酶”对糖底物特异性要求较低,可以利用不同来源的多糖修饰目的蛋白。利用此优点,将具有免疫原性的多糖抗原转移至合适的受体蛋白上,通过一步生物交联法直接产生与天然多糖具有相同免疫原性的多糖-蛋白结合疫苗,克服了利用化学方法制备多糖-蛋白结合疫苗费时、费力、产物结构不均一等缺点。目前,有关一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗的研究多集中于空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统。空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统的寡糖转移酶Pg1B要求糖底物的还原末端的第一个己糖的C-2位上有乙酰氨基,且第二个糖残基与第一个糖残基不以β(1-4)糖苷键连接,其糖基化作用位点的氨基酸保守序列为Asp/Glu-Y-Asn-X-Ser/Thr。而脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统的寡糖转移酶Pg1L与绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统的寡糖转移酶PilO对糖底物的要求低于Pg1B,C-2位无乙酰氨基的糖基均是其底物,然而,PilO只能将较短的寡糖或一个O-多糖重复单位作为糖底物,因此,利用PilO制备多糖-蛋白结合物具有一定的局限性,Pg1L具有更加广阔的应用前景。PglL与PilO对蛋白底物特异性的研究较少,目前脑膜炎奈瑟球菌MC58的菌毛蛋白PilE和绿脓杆菌1244的菌毛蛋白PilA分别是PglL和PilO的唯一蛋白底物。本研究以脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统为研究模型,通过在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,考察寡糖转移酶PglL能否利用异源的大肠杆菌O157型O多糖修饰目的蛋白PilE,从而为建立一步生物交联法制备多糖蛋白结合疫苗技术提供基础。本研究选取O多糖合成天然缺陷的大肠杆菌K12系列菌株W3110,通过Red重组技术敲除W3110的O抗原连接酶基因waaL,以阻断其利用O多糖合成LPS的途径,从而解决LPS合成途径与糖基化修饰途径竞争“异源多糖”的问题,构建宿主菌CLM24。然后,通过在CLM24中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE和寡糖转移酶基因pglL,在CLM24中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统。为了检验该O-糖基化修饰系统是否正常发挥糖基化修饰菌毛蛋白PilE的功能,本研究首先通过共表达大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL,修复CLM24的016型O多糖合成能力,研究Pg1L能否利用CLM24的016型O多糖修饰PilE。用抗PilE上His-tag的单抗进行western印迹检测,显示在16℃IPTG诱导条件下,单表达PilE-His的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his在相对分子质量19×103处有特异条带,而同时表达PilE-His、PglL和WbbL的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL不仅在相对分子质量19×103处有特异条带,而且在相对分子质量(40-60)×103处也出现了特异的梯状条带,这表明,本研究在大肠杆菌CLM24中构建的脑膜炎奈瑟球菌O糖基化修饰系统能够发挥糖基化修饰菌毛蛋白PilE。在此基础上,本研究通过PCR扩增大肠杆菌O157：H7的O多糖合成基因簇,构建克隆载体pACYC184-O157,共转化构建了O-糖基化修饰系统的宿主菌,用抗PilE上His-tag的单抗和抗O157多抗分别进行western印迹检测,结果表明,在建立了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌中转入大肠杆菌0157的O多糖基因簇克隆载体的重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157在相对分子质量(40-60)×103处同样产生特异的梯状条带。以上结果显示,本研究在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得了多糖-蛋白结合物,从而为一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供技术基础。